201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B 17 18 képződési szintjük és könnyű előállításuk következtében. A szintetikusan előállított vakcinák esetén elsődleges fontosságú, hogy a szintetikus immunogénnel szemben termelődő antitest felismeri-e az autenti- 5 kus molekulát, és vajon az antitest rendelkezik-e a megfelelő védelem kialakításához szükséges biológiai tulajdonságokkal. Az immunfluoreszcencia vizsgálat és a CSP-reakció eredménye szerint az E. coliban termelt polipeptidekkel szemben képződő 10 antitest reagál a sporozoit felületével, és így felismeri az autentikus CS-proteint. Állatkísérletekben és emberben is kimutatták, hogy a CSP-antitest jelenléte jelentősen összefügg a protektiv immunitással. Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárással előál- 15 lított proteinek ellen termelődő an titestek gátol ják a humán hepatoma sejtek sporozoitok általi invázióját in vitro, igen jelentős.Hollingdale és munkatársai (lásd fent idézett munkájuk) kimutatták, hogy mind a Pialciparam, mint a P. vivax elleni Mab-ok, vala- 20 mint a fenti malária-fajok ellen immunis emberekből nyert poliklonális szérum is gátolják a sporozoitinváziót. Ezért a sporozoitok invázió-gátlásának in vitro vizsgálata megfelelő vizsgálati módszert jelent a protektiv antitestek kimutatására. Afent ismerte- 25 tett vizsgálatok eredményei összességükben azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vakcinát a humán gyógyászatban P. falciparum által okozott fertőzések elleni védelemre használhatjuk. 30 Ä találmány szerinti eljárással előállított rekombináns proteinek immun-válasza Freund-féle komplett ad juvánssal vagy alummal egyaránt növelhető, amint azt ELISA-titerük, felületi reaktivitásuk (IFA és CSP) és sporozoit-inváziót gátló hatásuk 35 vizsgálatakor megállapítottuk. A Freund-féle sai is a találmány oltalmi körébe tartoznak. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az ember Plasmodium falciparum által okozott fér tőzése elleni vakcina hatóanyagát képező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a Plasmodium falciparum CS-protein 16-112 Asn- Ala(Val)-Asn(Asp)-Pro ismétlődő egységét - ahol az Asn-Ala-Asn-Pro ismétlődő egység az összes ismétlődő egység legalább 80%-át teszi ki - kódoló DNS-szekvenciát és kívánt esetben ehhez fuzionálva egy heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-t egy regulátor elemhez működőképesen kapcsolva valamely E. coli expressziós vektorba illesztjük, a vektorral E. colit transzformálunk, a transzformált E. colit tenyésztjük ésa képződött polipeptidet a tenyészetből elválasztjuk és tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ismétlődő egységet kódoló szekvenciaként a CS-proteint kódoló szekvencia XhoIIXhoII régióját vagy annak egymás utáni ismétlődéseit használjuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val- Asp-Pro) i ismétlődő egységet kódoló szekvenciát illesztjük az expressziós vektorba. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló szekvenciaként az Rtet32 polipeptidet, Rtet86 polipeptidet, RNS1 polipeptidet, NS ÍR polipeptidet, RG polipeptidet, RLA polipeptidet, RN polipeptidet kódoló szekvencia egyikét illesztjük az expressziós vektorba. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellekomplett adjuváns emberben nem használható, mimezve, hogy kódoló szekveniaként az vel lázat okoz,granulomákat vált ki és tuberkulin-túlérzékenységet eredményez. Az alumot jelenleg már RlGtet86, R32G, bevezetett vakcinákban -példáuladiftéria ésa teta40 R32tet86. R48G, nusz toxoid valamint az egyik legújabb vakcina, a R48tct86, R64G, Hepatitis B esetén - is használják adjuvánsként. HaR16tet32, R80G, tékonysága és a humán gyógyászatban régóta tartó R32tet32, R112G, biztonságos használata bizonyított. R48tet32, R16LA, 45 R64tet32, R32LA, 13. példa R80tet32, R16NS1, Vakcina előállítása R96tet32, R32NS1 A találmány szerinti eljárás értelmében például R112tet32, R48NS1, az alábbi módon készíthetünk vakcinát. R16G R64NS1 3%-os vizes, puff erőit alumínium-hidroxid-ol-50 NS1R48, R32N dathoz (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH 6,8; szűréssel sterilizálva) ugyanezen összetételű puff erben oldva adjuk keverés közben a találmány szerinti eljárással előállított nolipeptidet, a peptidre nézve 100 pg/ml, az Ar+-ra nézve 1,0 mg/ml végkoncentrációban. A pH-t 6,6 értéken tartjuk. Az elegyet egy éjszakán át 0 °C körüli hőmérsékleten tartjuk. 0,005% végkoncentrációban timerszolt adunk hozzá. A pH-t ellenőrizzük, és szükséges esetben 6,8-ra állítjuk. Noha a találmány szerinti eljárást a fentiekben részletesen ismertettük, beleértve az előnyös megoldásokat is, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körét nem kívánjuk a fenti megoldásokra korlátozni, hanem az ismertetett megoldások összes módosítá55 60 65 polipeptidek egyikét kódoló szekvenciát illesztjük az expressziós vektorba. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló szekvenciaként az R32tet32 vagy R32LA polipeptidet kódoló szekvenciát ülesztjük az expressziós vektorba. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kódoló szekvenciát regulátor elemként a PL-promotert és a cll transzlációt iniciáló helyet magában foglaló cll riboszoma-kötőhelyet tartalmazó elemhez kapcsoljuk működőképesen. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kódoló szekvenciát regulátor elemként a pASl regulátor elemhez kapcsoljuk működőképe-10
