201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B ekben ismertetett módon használjuk az R32N polipeptid előállítására E. coliban. AzR32N szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 1s-(Asn- Val-Asp-Pro) i ]n-N5-C, ahol n értéke 2 és N5 az NS1 génből származó 5 amínosavat jelenti. Közelebbről, az N5 az alábbi szekvenciának felel meg: Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C. Az R32N az E. coli összes proteinjének közel 5%át teszi ki. 9. példa Antitest-válasz - ELISA AzR16tet32, R32tet32 és R48tet32 rekombináns proteineket a fentiek szerint tisztítjuk, 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) szemben (PBS) dializáljuk, alikvotokra osztjuk és -80 'C-on tárol juk.AzelőállítottproteineketPBS- sel, alumínium-hidroxiddal (alum) vagy komplett Freund-féle adjuvánssal (CFA) összekeverve 0,5 ml-es dózisokat készítünk, amelyek protein-tartalma 50 p.g. A CFA-t (GIBCO, Grand Island, New York,USA)ésantigéntPBS-ben 1:1 arányban emulgeáljuk, 30 perces keveréssel, mechanikus keverőberendezésben. Az alumot gyógyszerkönyvi tisztaságú alumínium-hidroxid-gélből készítjük, PBS-sel végzett hígítással. Az antigént 4 'C-on, 12 órán át rotációs keverőben keverve adszorbeáljuk az alumon. A szuszpenziót további 12 órán át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszó megfelelő mennyiségét leöntjük, hogy0,80 mg Al-t és 50 pg rekombináns proteint kapjunk dózisonként. 6-8 hetes C57B1/6 egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine USA) (csoportonként 5 állatot) szubkután vagy intraperitoneális úton összesen 50 p.g proteinnel immunizálunk. Az állatoknak az első immunizálás után 4 héttel ugyanezen módon újabb dózist adunk, azzal az eltéréssel, hogy azoknak az állatoknak, amelyek az immunogént CFA-ban kapták, a proteint nem-komplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) emulgeálva adjuk. Egy hét elteltével a farok elvéreztetésével kapott teljes vért összegyűjtve, 4 'C-on megalvasztjukés centrifugálással elkülönítjük és a felhasználásig -80 'C-on tároljuk a szérumokat. Az egyes szérumok reakcióképességét egy 16 aminosavból álló szintetikus peptiddel szemben - amely a P. falciparum CS-protein négy ismétlődő egységének [(Asn-Ala-Asn-Pro)4] felel meg - enzimhez kötött immun-szorbens vizsgálattal (ELISA) vizsgáljuk, Dame és munkatársai (Science 225, 593/1984/) módszere szerint. A mikrotitráló lemezek lyukainak bevonására marha-szérumalbuminhoz (BSA) kapcsolt szintetikus peptid antigént használunk. 50 pl (0,1 pg) 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) (PBS) hígított vizsgálandó antigént pipettázunk a polisztirol mikrotitráló lemezek (Immunion 2Dynatech Laboratories, Alexandria, VA, USA) lyukaiba, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten (kb. 22 ’C) tartjuk. A lyukak tartalmát ezután leszivatjuk, gátló pufferral (BB, amelynek összetétele: 1,0% BSA, 0,5% kazein, 0,005% timerszol és 0,0005% fenolvörös PBS- ben) töltjük fel és 1 órán át szobahőmérsékleten tar t-13 juk. Az egér-szérumot sorozathígításos módszerrel BB-vel hígítjuk, és minden egyes lyukba 50 pl-t mérünk belőle. A lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, majd a lyukakat leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW20) eleggyel és 50 pl, 10% hővel inaktivált emberi szérumot tartalmazó PBS-sel 1/500-szorosára hígított kecske anti-egér IgG-vel konjugált torma-peroxidázt (H+I) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) mérünk az egyes lyukakba. Egy óra elteltével a lyukak tartalmát leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-TW20-szal és 150 pl szubsztrátot (1 mg 2,2’azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)/l ml O, 005% hidrogén-pcroxidot tartalmazó 0,1 mól/1 koncentrációjú cilrát-foszfát puffer, pH 4,0, a hidrogén-peroxidot közvetlenül felhasználás előtt adjuk a pufferhez) mérünk minden egyes lyukba. Egy óra elteltével 414 nm-en meghatározzuk az abszorpciót, ELISA lemez-leolvasó (Titertek Multiskan, Flow Laboratories Inc., McLean, VA) segítségével. Az R16tet32, R32tet32 és R48tet32 polipeptidek mindegyike olyan antitest-termelést váltott ki, amely ELISA tesztben reakcióképes volt. Az R16tet32, önmagában alkalmazva, kevésbé volt immunogén tulajdonságú, mint az R32tet32 vagy az R48tet32. Az alum és a CFA növelte a három találmány szerinti eljárással előállított protein immunogén tulajdonságát, és még 102 000-en felüli titer esetén is észlelhető antitest legalább egy vizsgálatban. 10. példa Antitest-válasz - IFA A 9. példa szerinti antiszérum vizsgálataink szerint erősen reagált autentikus P. falciparum CS-proteinnel, indirekt immunofluoreszcens antitest vizsgálatban (IFA). P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva és P. gallunaceum elleni reaktivitást nem tapasztaltunk. Az R32tet32-vel szembeni antiszérum csekély reaktivitást mutatott P. berghei ellen. Ez az eredmény összhangban van Hockmeyer és munkatársai (Proc. 3d Int’l. Symp. Immunobioi. Proteins Peptides, szerk. Atassi, M.Z., Plenum New York /nyomdában/) azon megfigyelésével, miszerint a P. falciparummal szembeni bizonyos Mab-ok (minoklonális antitestek) reagálnak a P. breghei sporozoitokkal IFA vizsgálatban. Asporozotikat fertőzött moszkitók nyál mirigyéből preparáljuk, lényegében Bosworth (J. Párásítók. 61, 769 /1975/) módszere szerint, sóoldattal vagy 0,5% BSA-t tartalmazó Medium 199-cel (GIBCO) hígítjuk, hemaci tómé tért alkalmazva számoljuk és 2000-5000 sporozoit/10 p.1 értékre hígítjuk. 10 pies alikvotokat mérünk a többlyukú, nyomott IFA-lemez minden egyes lyukába, szobahőmérsékleten, levegővel szárítjuk és -80 °C-on tároljuk. Az EFA-vizsgálatokat azzal kezdjük, hogy 20 pl térfogatú, BB-vel 1/100-szorosára hígított szérumot szélesztünk a szárított sporozoitokat tartalmazó IFA-lemez lyukaiba. Nedves kamrában, szobahőmérsékleten, 20 percen át végzett inkubálás után a szérumoldatokat leszivatjuk és a lyukakat 2 csepp PBS-sel mossuk. Az egyes lyukakba ezután 20 pi, BB-vel l:40-szeresére hígított, fluoreszcein-izotiocianáthoz kapcsolt kecske anti-egér antitestet (Kirkegard és Perry, Gaithersburgh, MD, USA) adunk. 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
