201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B mentumot a fent ismerteit módon illesztjük be a pTerm2 Bam Hl helyére. A pRl 6LA és pR32La kiónokat, amelyek egy, ületve kétXhoIIbeillesztést tartalmaznak a megfelelő orientációban, lényegében a fent ismertetett módon választjuk ki. Az R32LA-t lényegében a 3. példában leírt módon tisztítjuk. A pR 16LA-t és pR32LA-t a fenti ismertetett módon klóznozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben. Az R16LA és R32La szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) i s-(Asn- Val-Asp-Pro) 1 ]n-Leu-Arg-C, ahol n értéke 1, illetve 2. A C-terminális leucin és arginin a pTerm2-ben levő szintetikus kötőből származik. Az RI6LA közel 1%-át teszi ki az E. coli összes proteinjének, míg az R32La az összes sejt-proteinnek közel 5%-a. 6. példa R16NS1 polipeptid A pAS2deltaEH plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pAS 1 pBR322 eredetű nem létfontosságú Eco Rí - Hind Hl régióját töröljük. 10 pg pASl-et 20 egység Eco RI-vel és 20 egység Hind IH-mal hasítunk, 200 |xl puffer-közegben, DNS-polimerázzal (Klenow) kezeljük, ligázzal zárjuk, és E. coliba transzfomráljuk, lényegében a fent ismertetett módon. Azonosítunk egy olyan kiónt, amelyből a 29 bázispárból álló Eco RI - Hind Dl fragmens törölve van. A pAS ldeltaEH Bam Hl helyére beilleszt jük a pAPR801 1236 bázispárból álló Bam Hl fragmentumát (Young és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. U.SA., 80,6105 /1983/), amely az influenza vírus (A/PR/8/34) NS1 kódoló régióját tartalmazza, ami 861 virális eredetű bázispárból és a pBR322-ből származó 375 bázispárból áll. A kapott pASldeltaEH/801 plazmid az autentikus NSl-et (230 aminosav) kódolja. A fenti plazmidban megmarad a Bam Hl hely, a cH transzlációt indító hely és az NS1 kódoló szekvencia között. 10 pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Eco RI-vel és 20 egység Sál I-gyel hasítunk, 200 pl nagy ionerősségű pufferben (50 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5,1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl2,100 mmól/1 NaCl), 37 °C-on 2 órán keresztül, DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) kezeljük és ligázzal zárjuk, lényegében a fenti leírtak szerint. Izolálunk egy olyan kiónt, amelyből a 650 bázispárt tartalmazó Eco Rí-Sáli régió törölve van, A fenti pNS 1 deltaES plazmid az autentikus NS 1 -et kódolja. A pR16NSl plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8 1. kiónjából származó 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentumot a pNSldeltaES plazmid Bam Hl helyére illesztjük, és lényegében a fent ismertetett módon kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást. A pR16NSl-et E. coliban klónozzuk és kifejezzük, és az R16NSl-et lényegében a fentiek szerint tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a forralást elhagyjuk. AzRlőNSl szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) i s-(Asn- Val-Asp-Pro)i]n-N227, ahol n értéke 1 és N227 az NSl-ből származó 227 aminosavat jelenti. 11 A fenti módon előállított R16NS1 készítményben az R16NS1 a protein-tartalom több, mint 80%ára becsülhető, a forralás vagy ioncserélős lépés nélkül. AzRlőNSl meglepően magas, közel 25%-át képezi az összes sejt-proteinnek. 6A. példa R32NS1.R48NS1 ésR64NSl polipeptid Az R32NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NSl-ével azonos, azn értéke 2) lényegében a 3. példában leírtak szerint fejezzük ki E. coliban és tisztítjuk abból, a forralás elhagyásával. Az R32NS1 az R16NSl-gyel közel azonos mértékben képződik, és tisztasága is közel azonos. Az R48NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NSl-ével azonos, és n értéke 3), és az R64NS1- et (n értéke 4 az R16NS1 képletében) lényegében a fentiek szerint eljárva állítjuk elő E. coliban. Az R48NS1 közel 10%-át, azR64NSl közel 5%-át teszi ki az E. coli összes protein-tartalmának. 7. példa NS1R48 polipeptid A pR48tet86plazmidot Bam HI-vel hasítjuk és DNS-polimerázzal (Klenow) töltjük be a véget, lényegében a fent leírt módon. A plazmidot eztuán Ban n-vcl hasítjuk, a fent ismer tetett módon, ily módon egy 672 bázispárból álló, 3 Xho fragmentumot hordozó fragmentum és 96 bázispár válik szabaddá a tetraciklin rezisztencia génből. 10 pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Nco I-gyel hasítunk 200 pl nagy ionerősségű puf ferben, 37 °C-on 2 órán át, és a véget DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) töltjük be, a fent ismertetett módon. Az NS 1-ben az Nco I hely a 81. aminosavnak megfelelő kodonban van. A plazmidot ezután Ban H-vel hasítjuk a fent ismertetett módon, ezáltal töröljük a megmaradt NS1 kodonokat és a tetraciklin rezisztencia gén egy részét, és pASldelta/801-1 plazmidot kapunk. A 672 bázispárból álló Bam Hl (betöltött végű) - Ban II fragmentumot a pASldctaEH/801-1 plazmidba illesztve állítjuk elő a pNS 1R48 plazmidot. A fenti plazmidot az előzőekben ismertetett módon fejezzük ki E. colibein. A kapott NS 1R48 szekvenciája az alábbi: N-8ÍN-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn- Val-Asp-Pro) i ]n-T32-C, ahol 8 IN az NS1 N-terminális 81 amiuosavját jelenti, n értéke 3, és T32 jeletnése a fent megadott. Az NS 1R48 az összes sejt-protein közel 5%-át képezi. 8. példa R32N polipeptid 10 pg pR32NSl plazmidot 25 egység Hind IH- mal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, 2 órán át 37 °C-on, és a véget DNS-polimerázzal tölt jük be, a fent ismertetett módon, pR32NSl-l plazmidot kapunk. A Hind Hl hely az NS 1 kódoló régiójában az 5. aminosav-maradékot kódoló kodonban van. 100 ng p32NSl-l -et ezután a fent ismertetett módon ligázzal zárunk. A kapott pR32N plazmid most egy TAA terminációs kodont tartalmaz az NS1 kódoló szekvencia 5. kodonjában. A pR32N plazmidot a fenti12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
