201801. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pankreász-aktivitást fokozó proteolitikus komplexek és ezeket tartalmazó állattakarmányozási készítmények előállítására
HU 201801 B Ezek a szekunder metabolitok és ezek az enzimek így endocellulárisak maradnak;- hogy növeljük a II, ül és IV típusú proteázok termelését;- hogy a különösen fontos II típusú proteáz termelése növekedjék. A fermentációs idő 72 óra és 96 óra között változhat, és a tápközeg végső titere mintegy 15000 Anson egység/ml, ez sokkal felette van annak a 3000 Anson egység/ml-nek, amelyet a 2 034 559 lajstromszámú francia szabadalmi leírásban említenek. Egy Anson egység (rövidített formában A.U) az enzimének az a mennyisége, amely 10 percig 25 °C hőmérsékleten és pH 7,5-nél inkubálva, denaturált hemoglicin jelenlétében kibocsátódik ebből a szubsztrátumból, és tirozin 1 mg-jával egyenértékű a triklórecetsawal ki nem csapható szűrletben, 280 nm-nél spetrofotometriás abszorpcióval meghatározva. Kinyerés A micéliumot a termelő tápközegből derítő szűréssel különítjük el. Derítőszerként előnyösen Clascel-t (agyagásvány) használunk. A komplexet az enzimek elkülönítésének klasszikus technikájával végzett kinyerés helyett (egymás utáni kicsapások, oszlopon való áteresztés) sokkal korszerűbb technikával, ultraszűréssel különítjük el. Az ultraszűrő membránokat, amelyek a legjobb kitermelést adják, kikísérleteztük. Úgy találtuk, hogy azok a membránok, amelyek 30000 molekulatömegnek megfelelő kizárási küszöbbel bírnak, nem megfelelők, mivel ezek lehetővé teszik, hogy a komplex több, mint 50%-a átmenjen, míg azok a membránok, amelyek 1000 molekulatömegnek megfelelő kizárási küszöbbel bírnak, azért nem megfelelők, mivel nem teszik lehetővé a komplex elkülönítését bizonyos kis molekulatömegű raetabolitoktól. Végül is azt figyeltük meg, hogy olyan membránok alkalmazása felel meg, amelyek a 2000 és 12000 molekulatömeg tartománynak megfelelő kizárási küszöbbel rendelkeznek. Lehet alkalmazni pl. a MILLIPORE cég által P.T.G.C. néven forgalmazott poliszulfon membránt, amelynek kizárási küszöbértéke 10000 molekulatömegnek felel meg. A kapott koncentrátumot porlasztással kezeljük (automatizálás”). Végül a tiszta, nyers gyapjú (”bézs”) színű por formájában kapott komplex titrálva 2000 A.U/mg értékű, ahol a közömbös segédanyagot, pl. túlszárított keményítőt, amelyet a porlasztás előtt vagy után adunk az anyagba, a számításnál nem vesszük figyelembe. A teljes kitermelés a proteolitikus aktivitásban mintegy 70%, amely nagyobb, mint az a kitermelés, amelyet akkor kapunk, amikor az ipari eljárásban egymást követő kicsapásokat vagy oszlopon való átbocsátást alkalmazunk (ez 50% alatt van). Az új komplex adatai- enzim-elektroforézissel meghatároztuk a II, III és IV típusú proteázok jelenlétét, la és Ib proteázok és peptidázok nélkül;- a II típusú proteáz túlsúlyát, amely a proteolitikus aktivitás legalább 40%-át képviseli; a III vagy IV proteázok a teljes aktivitásnak egyenként legfel3 jebb 30%-át képviselik. Az új komplexet alkotó proteázok adatai II típusú proteáz: Molekulatömeg: mintegy 18000; Izoelektromos pont: mintegy 9,0; pH 8,0-nál végzett elektroforézisnél az elmozdulás a katód irányában viszonylag kis sebesség. III típusú proteáz: Molekulatömeg: mintegy 14000; Izoelektromos pont: mintegy 9,0; ph 8,0-nál végzett elektroforézisnél az elmozdulás a katód irányában közepes sebességű. IV típusú proteáz: Molekulatömeg: mintegy 16500; Izoelektromos pont: mintegy 9,0; pH 8,0-nál végzett elektroforézisnél az elmozdulás a katód irányában viszonylag nagy sebességű. Alkalmazás az állattakarmányozásban A jelen találmány szerinti komplex alkalmazása az állattakarmányozásban akkor adja a legjobb eredményeket, ha az alábbiak szerint használjuk ezeket. Nagy nyers fehérje tartalommal bíró takarmányok alkalmazása Úgy találtuk, hogy a komplex az állatok növekedését stimulálja, mégpedig a fehérje-képződést jobban, mint a zsír-képződést. így pl. megfigyelhető, hogy a kezelt és levágott borjak és sertések húsa néha jobb minőségi osztályba sorolható, mivel több izmot és kevesebb zsírt tartalmaznak, de ez a javulás nem minden esetben következik be. Feltételeztük, hogy a komplex fehérje-anabolizmust, stimuláló hatását csak akkor használhatjuk ki teljesen, amikor az alkalmazott takarmánynak megfelelő nyers fehérje tartalma van. Ezt hatásosan bizonyítjuk azokkal a kísérletekkel, amelyeket a fehérje-anabolizmus stimulálásának szabályos értékelése céljából végeztünk; a megfigyeléshez a feltételek egyike a nagy fehérjetartalmú takarmány alkalmazása, vagyis nagy össz-nitrogén tartalmú (rövidített formában T.N.M) takarmány alkalmazása volt. így pl. a T.N.M tartalom a következő: 2: 23% azoknál a takarmányoknál, amelyeket csirkék kezdeti növekedéséhez szánunk; 2 22% a borjak vagy bárányok szopásához alkalmazott takarmányoknál; 2 20% a választási malacok takarmányához; & 16% a kocák egyedüli takarmányához a vemhesség és szoptatás időszakában. Az ilyen takarmányok általában nem felelnek meg a szokásos gyakorlatnak a következők miatt:- Az állatok nem mindig képesek teljesen megemészteni a nagy T.N.M. szintű takarmányt, és a meg nem emésztett fehérjék a bélflóra egyensúlyának felbomlását idézhetik elő proteolitikus baktériumok feleslegének kifejlődésével és hasmenésének gyakoriságának növekedésével. Ezek a kockázatok visszaszorulnak, amikor a komplexet alkalmazzuk, mivel az állatoknak így lehetősége van hatékonyan asszimilálni a nagy T.N.M. szintű takarmányokat. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
