201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére
HU 201800 B 15 16 nek meg azoknál a helyeknél, amelyeket PA aktivitással bíró molekulák foglalnak el. Immunpredpitáció esetében a metabolikusan in situ ^S-metioninnal jelzett fehérjéket először fajlagos antitestekkel reagáltatjuk. Az immunkomple- 5 xeket, amelyek így kifejlődnek, ezután szelektíven eltávolítjuk a tenyészfolyadékból A-fehéije-Sepharose gyöngyökön (Protein A-Sepharose, Pharmacia) végzett abszorpcióval, és ezt követő eluálással. 10 Az ilyen módon izolált, a metioninnal jelzett fehérjéket SDS-akrilamid gélen szétválasztjuk, és helyzetüket lokalizáljuk; az akrilamid gélt röntgenfilmre kitéve. A fibrin autográfiánál két elkülönült elektrofo- 15 retikus csíkot mutatunk ki (amelyek mindegyike fibrinolitikus aktivitást mutat) a diploid fibroblasztok (WI-38) egybefüggő tenyészeteiből kinyert, (szérum-mentes) használt tápközegben. Az elektroforetikus csíkok egyike az egyetlen láncú uroki- 20 názzal (SCU-PA) vándorol együtt (55000 Mr), és a másik csík a tisztított t-PA-van vándorol együtt (63000-65000 Mr), ugyanakkor csak egyetlen fibrinolitikus enzimet találunk a Bowes melanóma tenyészetekből nyert használt tápközegben (szintén 25 63000-65000 Mr). Amikor az akrilamid géleket felülrétegezzük anti-urokináz IgG-t (150 p.g/ml tartalmazó fibrin agarral, a diploid tenyészetből származó az a fibrinolitikus enzim, amely az egyedi láncú urokinázzal együtt vándorol, és maga az egyedi 30 láncú urokináz enzim egyaránt semlegesítődik (azaz az SCU-PA-nak tulajdonítható antitest nélkül megjelenő felsztitulás zónái anti-urokináz IgG jelenlétében eltűnnek). Hasonlóképpen, amikor az akrilamod géleket anti-t-PA IgG-t (50 jjig/ml) tar- 35 talmazó fibrin agarral rétegezzük felül, a diploid tenyészetekből származó annak a fibrinolitikus enzimnek tulajdonítható feltisztulás zónája, amely enzim együtt vándorol a tisztított t-PA-val, valamint a tisztított t-PA zónája, és a Bowes-féle használt táp- 40 közegből származó fibrinolitikus enzim zónája mind eltűnnek. Az immunredpitációs tanulámyokból származó adatok megerősítik és kiterjesztik a korábbi vizsgálati mérések eredményeit. Ezzel a technikával le- 45 hetségessé válik a fajlagos antitesttel kicsapott enzimek molekulatömegének meghatározása összehasonlítva ezek relatív mozgékonyságát ismert molekulatömegű 14C-jelzett fehérjék mozgékonyságával. A Bowes melanóma t-PA ellen készített fajla- 50 gos anti-t-PA IgG-t és fajlagos anti-UK IgG-t (az Abbokinase elleni szérumból tisztítva) alkalmazva megállapítjuk, hogy a WI-38 diploid fibroblaszt tenyészetben talált két fibrinolitikus enzim megfelel a 63-65000 Mr molekulatömegű, illetve 55000 Mr 55 molekulatömegű fehérjéknek, ezek a molekulatömegek Bowes melanóma t-PA-nak, illetve a humán egyetlen láncú urokináznak (SCU-PA) felelnek meg. Ezt az azonosítást nem lehetne elvégezni fibrin autográfiával, mivel az enzimek kezelése redu- 60 kálószerrel, amely kötelező lépés a molekulatömeg meghatározásában, elroncsolja a fibrinolitikus aktivitást. Az immunprecipitációs adatok azt igazolják, hogy a Bowes melanóma sejtek csak t-PA-t termelnek, mivel SCU-PA-t nem lehet kicsapni an- 65 ti-UK IgG-vel olyan körülmények között, amelynél az SCU-PA-t diploid tenyészfolyadékból kicsapjuk. Az adatok azt is mutatják, hogy az ECGF és a heparin emeli mind a t-PA, mind az SCU-PA szintjét, mivel az immmunrecipitálható t-PA és SCUPA mennyisége növekszik, amikor a sejteket ezeknek az adalékoknak a jelenlétében tenyésztjük. Ezek az adatok az I-VIII. Táblázatokban bemutatott ELISA eredményekkel együtt azt mutatják, hogy az embrió tüdőszövetből származó humán diploid tüdő fibroblasztok két fibrinolitikus enzimeket termelnek, egy urokináz típusú és egy szöveti típusú plazminogén aktivátort. Mindkét enzim termelésének szintje jelentésen megnövekszik ECGF és heparin kombinációjának hozzáadására a tápközeghez. A t-PA és SCU-PA így kapott megnövekedett termelése elegendő arra, hogy lehetővé tegye fajlagos t-PA és SCU-PA mRNS izolálását normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtekből. Ez a találmány továbbá eljárást nyújt t-PA és SCU-PA termelésének stimulálására emlősökben, valamint eljárást gyógyászati kompozídók előállítására. Nem régi bizonyítékok jelzik, hogy az endotéliális sejt polipeptid növekedési faktorok vagy mitogének családjának tagjai fontos szerepet játszanak a véredény homeosztázisban (Macig T.: Progress in thrombosis and Hemostasis 7,167 /1984/). Ezekről a faktorokról úgy véljük, hogy az endotéüális sejt vándorlás és burjánzás fajlagos és hatékony szabályozóiként működnek az új véredények képzésének (neovaszkularizáció) folyamatában, amely révén új véredények képződnek (azaz angiogenezis). Ezeknek a faktoroknak biológiai aktivitásáról úgy hiszik, hogy az endotéliális sejtfelületen jelen levő nagy affmitású polipeptid receptor által közvetített, és a heparin glikozaminglikánnal való szerkezeti kölcsönhatás révén van potencirozva (Schreiber A.B. és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA, 82 (6), 138 /1985/; Friesei R. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 26(7), 581 /1986/). Az enditéliális sejtnövesztő faktorok kölcsönhatását endotéliális sejtektől eltérő sejteken levő receptorokkal is közük ezek a szerzők, ilyenek pl. a humán fityma fibroblasztok, rágcsáló BALB/c 3T3 fibroblasztok, humán epidermoid karcinóma (A-431) és humán állkapocs karcinóma (A-549). A jelen találmány in vitro szempontjai szerint, amelyeket fentebb leírtunk valamely endotéüális sejtnövesztő faktor és heparin stimulálják a humán diploid tüdő fibroblaszt sejteket, hogy több t-PA-t és SCU-PA-t termeljenek. A jelen találmány másrészről eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és egyetlen láncú plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének in vivo stimulálására, beleértve az embert is, ha erre szükség van; az eljárás abból áll, hogy az adott emlősnek hatásos mennyiségű heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. A fentebb leírt endotéüáüs poüpeptid mitrogének, nevezetesen az ECGF, savas FGF és EDGF-II az előnyösek a találmány ehhez a szempontjához, és az ACGF a legelőnyösebb. A beadásnak az a módja előnyös, amelyben a heparin vagy kis molekulatömegű heparin és az endotéüális sejtnövesztő faktor kombi-9
