201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B a sejttenyésztés ellenőrzését. A találmány további előnyeit a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására szolgáló eljárás és a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó készítmény itt következő részletes leírásában világítjuk meg. A részecskéket mindenekelőtt zselatinból alakítjuk ki. A zselatint szárazon szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és leválasztjuk a sejtek optimális fejlődését lehetővé tevő méretű frakciót, amelyet térhálósító szerrel kezelünk. Térhálósító szerként előnyösen formaldehidet, illetve dialdehideket, például glutáraldehidet, glioxált alkalmazunk. A térhálósító szerrel történő kezelésnél zselatin blokkpolimer keletkezik, ez adja a mikrohordozó mechanikai, kémiai és termikus stabilitását. Kiindulhatunk különböző zselatin oldatokból is, például vízben, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban vízmentes ecetsavban vagy más fehérjeoldószerben oldott zselatinból. Előnyös a zselatin vizes oldata. A részecskék kialakítása érdekében a zselatin oldatot térhálósító szerrel kezeljük és a keletkező zselatin blokkpolimert aprítjuk olyan szabálytalan alakú részecskékké, amelyek mérete a sejtek optimális fejlődését teszi lehetővé. Formaldehid térhálósító szer alkalmazásakor a zselatin molekulák térhálósodása úgy történik, hogy a formaldehid először a zselatinban levő lizin E-amino csoportjával reagál és a keletkező hidroximetil-származék egy másik szabad aminocsoporttal kapcsolódik össze. így a zselatin molekulákat a formaldehid molekulákból származó metilén csoportok kapcsolják egymáshoz, ez a termék átlátszóságát és stabilitását biztosítja. Dialdehid térhálósítószer alkalmazásakor a dialdehid mindegyik aldehid csoportja Schiff-bázist képez a zselatinmolekulák szabad amino-csoportjával. A keletkező N=CH-kötése stabilitása és a színtelen végtermék előállítása érdekében az előállított zselatin blokkpolimert regeneráló reagenssel kezeljük. A zselatin blokkpolimerből kialakított, szabálytalan alakú részecskék felülete is szabálytalan, nem síklapokkal határolt, ez pedig kedvezőtlen a sejtek megtapadása, növekedése és szaporodása szempontjából. A sima felületű részecskéket proteolitikus enzimmel, például tripszinnel, kollagenázzal történő kezeléssel alakítjuk ki. A részecskék kimosása után következik a stabilizálásuk. Ha térhálósítószerként dialdehidet használunk, akkor a stabilizálást úgy végezzük, hogy a részecskéket ismételten dialdehiddel, majd regeneráló reagenssel kezeljük. Regeneráló reagensként olyan vegyületeket használunk, amelyek a C = N kötéseket és az aldehid csoportokat reagáltátják, például alkálifémek bórhidridjeit, hidrogénperoxidot stb. Ha térhálósító-szerként formaldehidet használunk, akkor a térhálősítást úgy végezzük, hogy a zselatin blokkpolimer részecskéket ismételten formaldehiddel kezeljük. Az eljárással olyan mikrohordozó készítményt kapunk, amely szabálytalan alakú, mechanikailag, kémiailag és termikusán stabil, 75-350 p.m méretű, 1,03-1,15 g/cm3 sűrűségű zselatin blokkpolimer ré-3 szecskákból áll. A találmány szerinti mikrohordozó készítmény a tenyésztendő sejtek felületével effektiv, biospecifikus kölcsönhatásba lép. A mikrohordozó törésmutatója és átlátszósága lehetővé teszi a sejtfejlődés kényelmes ellenőrzését. A mikrohordozó sima felülete és szabálytalan alakja a sejtek jó tapadását, rögződését és fejlődését eredményezi. A míkrohordozót a szokásos tenyészközegek nem károsítják és a sejtek tenyésztésére alkalmas mind laboratóriumi, mind nagyipari körülmények között. A találmány szerinti mikrohordozó készítmény sokkal nagyobb tisztasági fokú, mint az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozók, mivel az ismert eljárásokban alkalmazott szuszpendáló közegből (olaj, szénhidrogének) eredő szennyeződések teljesen elmaradnak. Ezek a szennyeződések azért károsak, mert a sejtekre mérgezőek. A találmány szerint mikrohordozó készítmény minősége azért is jobb az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozókénál, mert a szemcsenagyság-megoszlása homogénebb (a részecskék 98%-ának a mérete 100- 250 p.m között van). Az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozók részecskéinek csak 75-80%-a 100-250 p.m méretű. A találmány szerinti eljárás technológiai folyamata az ismert eljárásokhoz képest egyszerűbb, mivel elmarad a diszpergálás és a többszöri mosás folyamata, továbbá ennek megfelelően az eljárás készülékei is egyszerűbbek. A továbbiakban példákban mutatjuk be a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítási eljárásának alkalmazását és a mikrohordozó készítmény vizsgálatát. 1. példa 400 ml 50 °C hőmérsékleten előállított, 25%-os vizes zselatinoldatot szobahőmérsékleten intenzíven összekeverünk 150 ml 25%-os vizes glioxál oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 250 |xm-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 250 finnél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer-oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,5 liter tripszin-oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal mossuk a tripszin és a zselatin blokkpolimer fermentációs hasításánál keletkezett oldható termékek eltávolítása érdekében. A kimosott részecskékhez 100 ml 25%-os glioxál oldatot adunk és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A részecskéiéről a glioxál oldatot 100 p.m-es szitán leszűrjük, a szitán fennmaradt részecskéket 1 liter 3%-os vizes hidrogén-peroxidoldatban szuszpendáljuk és 30 percig állni hagyjuk. Ezután a míkrohordozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal mossuk. A 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált míkrohordozót autoklávban 120 °C hőmérsékleten 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,07 g/cm3 sűrűségű, 200- 250 p.m részecskenagyságú míkrohordozót kapunk. A mikrohordozót zöldmajmok felületfüggő vesesejtjeinek tenyésztésénél vizsgáljuk. A tenyésztést 20 ml-es rázott lombikban végezzük, a lombikba 150 ml 5% borjúszérummal ellátott 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
