201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B Eagle-táptalajt helyezünk. A mikrohordozó koncentrációja 8.103 részecske/táptalaj ml. A tenyésztés eredményét az 1-10. példák eredményeit öszszefoglaló táblázatban adjuk meg. 2. példa 200 ml 50 °C hőmérséklelten előállított, 35%-os vizes zselatin oldatot szobahőmérsékleten intenzíven összekeverünk 100 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 200 pm-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 200 pmnél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os foszfátpuffer oldattal készített 0,5%-os kollagenáz oldattal 37 ± 1 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 270 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 230 ml kollagenáz oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal mossk. A kimosott részecskéket egymást követően szobahőmérsékleten 130 ml 25%-os glutáraldehid oldattal, az átalakulatlan glutáraldehid eltávolítására 0,15 mól-os NaCl oldattal, majd 0,5 liter 2%-os nátrium-bórhidrid oldattal kezeljük, végül bő vízzel mossuk, míg a mosófolyadék pH-értéke semleges lesz. A mikrohordozót ezután 0,5 liter 0,15 mól-os NaCl-oldatban újra szuszpendáljuk, 10-15 perc múlva egy friss adag izotóniás NaCl-oldattal kimossuk, majd 120 °C hőmérsékleten, autoklávban, 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 250 g szabálytalan alakú, 1,05 g/cm3 sűrűségű, 150-200 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 3. példa A mikrohordozót a 2. példában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de kiindulási oldatként 20%-os zselatin oldatot, proteolitikus enzimként 0,75%-os kimotripszin oldatot és regeneráló reagensként 3%-os hidrogén-peroxid-oldatot alkalmazunk. Az eljárással 250 ml szabálytalan alakú, 1,06 g/cm3 sűrűségű, 150-200 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 4. példa A zselatin blokkpolimer részecskéket az 1. példában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de a részecskéket 0,7510,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal 25 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A többi kezelési lépés megegyezik az 1. példában leírtakkal. Az eljárással 475 g szabálytalan alakú, 1,06 g/cm3 sűrűségű, 200-250 p részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 5 5. példa A zselatin blokkpolimer részecskéket az 1. pél-5 dában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de a részecskéket 1,25 1 0,06 mól-os, pH = 6,4 értékű foszfát-puffer oldattal készült 0,75%-os kimotripszin oldattal 20 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A többi kezelési lépés megegyezik az 1. példában leírtakkal. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,08 g/cm3 sűrűségű, 200-250 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 6. példa 200 g aprított és szitált, 75-90 p részecskeméretű száraz zselatint vízben való duzzasztás után 10 percig 500 ml 40%-os formaldehid oldattal kezelünk. A formaldehid feleslegét vízzel kimossuk, és a zselatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,51 tripszin-oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal kimossuk és 10 percig 500 ml 40%-os formaldehid oldattal kezeljük. A mikrohordozót ezután leszűrjük és 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mól-os NaCl oldatban szuszpendált mikrohordozót 120 °C hőmérsékleten, autoklávban 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 550 g szabálytalan alakú, 1,15 g/cm3 sűrűségű, 160-200 p részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 7. példa 200 g aprított és légsugaras szitálással szitált, 8-100 pm száraz részecskeméretű száraz zselatint 500 ml 20%-os formaldehid oldattal kezelünk. A továbbiakban az előállítási folyamat hasonló az 1. példában leírtakhoz, de proteolitikus enzimként 25%-os kimotripszin oldatot alkalmasunk és a részecskéket 20%-os formaldehid oldattal stabilizáljuk. Az eljárással 590 g szabálytalan alakú, 1,02 g/cm3 sűrűségű 180-250 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 8. példa 200 g aprított és szitált, 70-90 p száraz részecskeméretű száraz zselatint 500 ml 30%-os formaldehid oldattal 10 percig kezelünk. A formaldehid feleslegét vízzel kimossuk, és a szelatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,5 1 tripszin oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk és 500 ml 30%-os formaldehid oldattal kezeljük. A mikrohordozót ezután leszűrjük és 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mólos NaCl-oldatban szuszpendált mikrohordozót 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
