201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B A találmány tárgya eljárás sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti eljárással előállított mikrohordozó készítmény. A találmány a mikrobiológiai iparban alkalmazható. A sejtek nagyipari tenyésztésének területén a világon összegyűlt, jelenlegi kísérleti és gyakorlati tapasztalatok tanúsítják a felülettől függő sejtek mikrohordozón történő pszeudoszuszpenziós tenyésztési módszerének előnyeit és perspektíváját. A módszer elve az, hogy a tápoldatban szuszpendált mikrohordozón rögzített sejtek szaporodnak és növekszenek. Mikrohordozón jelenleg például a következő sejtek tenyészthetők: zöldmajmok veséinek sejtjei, primer és szekunder kultúrák; csirkeembrió sejtek, primer és szekunder kultúrák. Ismert olyan eljárás a sejttenyésztésre mikrohordozók előállítására W082/0060 sz. PCT közzétételi iratban (nyilvánosságra hozve: 1982.03.04) leírtak szerint, amely eljárásnál a duzzasztott, szférikus zselatin-részecskék előállítása zselatin oldat szuszpendáltatásával történik. A zselatin oldatot először 100 |im lyukbőségű szitán erőteljes keverés közben, toluol-kloroform elegyben, felületaktív anyag jelenlétében átszitálják. Acetonos mosás és szárítás után a leválasztott, 100 pm-nél kisebb zselatin-részekcskéket vízben szuszpendálják, duzzasztják, glutáraldehiddel kezelik, és ismét 100 jtm lyukbőségű szitán átszitálják. AZ így leválasztott részecskéket szuszpendálják és autoklávban sterilizálják. A kapott mintát 250 jim lyukbőségű szitán átszitálják, a leválasztott részecskéket pedig 100 jim lyukbőségű szitán ismét szitálják és újra autoklávban kezelik. Az eljárás hátránya, hogy bonyolult, amely abból ered, hogy a zselatinoldatot egy speciálisan erre a célra kialakított reaktorban kell szuszpendálni, és bonyolult összetételű, háromkomponensű elegy szükséges az eljáráshoz. Ezen kívül hátrányos még, hogy ez az ismert eljárás az előállítandó termék többlépéses kezelését igényli, tűzveszélyes és mérgező oldószereket kell használni, és a fő reagensből, a glutáraldehidből nagy mennyiség szükséges. Másik ismert eljárást ír le a 1161548 sz. szovjet szabadalmi leírás (nyilvánosságra hozva: 1985.06.15.). A sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozót ebben az eljárásban úgy állítják elő, hogy a zselatin oldatot intenzív keverés közben apoláris szerves oldószerek elegyében szuszpendálják és a folyamat közben az elegyhez dialdehid térhálósítószert adnak. A kapott szférikus részecskéket, azaz a mikrohordozót szitán átszitálják, szerves oldószerrel, majd felületaktív anyag jelenlétében vízzel mossák. Ezután regeneráló szerrel, pl. 10%-os hidrogén-peroxid oldattal kezelik a keletkező Schiffbázis regenerálása, a használati és tárolási stabilitás kialakítása, valamint színtelenítés céljából. A regenerálást követő mosás után leválasztják a 100-250 pjn közötti méretű részecskéket. Az eljárás hátránya, hogy kivitelezése bonyolult, amely abból ered, hogy a szuszpendáláshoz speciálisan kialakított reaktorra van szükség és többkomponensű reakcióközeget kell alkalmazni. Az eljárásban bonyolult az előállított mikrohordozóból a diszpergáló szer kimosása is. 1 Az ismert eljárások szférikus alakú mikrohordozó előállítását teszik csak lehetővé, ez a sejttenyésztésnél nem optimális, mivel a sejtek nehezen rögződnek a mikrohordozó felületére. Célul tűztük ki, hogy a technológiai munkafolyamat megváltoztatásával a mikrohordozó előállítási technológiáját az ismert eljárásokhoz képest leegyszerűsítjük és egyben az előállított mikrohordozó minőségét javítjuk úgy, hogy az a sejtek effektiv fejlődését segítse elő. A cél elérése érdekében a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására olyan eljárást alkalmazunk, amelyben a részecskéket a térhálósító szerrel kezelt zselatinból alakítjuk ki és a végterméket stabilizáljuk. A találmány szerint az eljárást úgy végezzük, hogy a szelatin részecskék kialakításához zselatin oldatot térhálósító-szerrel kezelünk, a keletkező zselatin blokkpolimert szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és az optimális sejtfejlődést lehetővé tevő 75-350 p_m méretű részecskéket leválasztjuk, illetve száraz zselatint szabálytalan alakú részecskékké aprítunk, az optimális sejtfejlődést lehetővé tevő 75-35 p.m méretű részecskéket leválasztjuk és ezeket kezeljük térhálósító szerrel. A részecskék kialakítása után, stabilizálásukat megelőzően proteolitikus enzimmel kezeljük azokat a felületük lesimítása érdekében. A találmány szerinti eljárással nagy tisztaságú jó minőségű mikrohordozót lehet előállítani, azaz a szuszpendáló közegből eredő szennyeződések - amelyek jelenléte a tenyésztendő sejtekre korábban mérgező hatást gyakorolt - nem fordulnak elő. Az előállítási technológia lépései is csökkentek az ismert eljárásokhoz képest és így egyszerűbbé vált az eljárás is. Szükségtelenné váltak a szuszpendálásnál alkalmazott komplikált berendezések is. A találmány szerinti térhálósító szerek lehetnek dialdehidek, illetve formaldehid. A mikrohordozó minőségének javítása és a tárolási stabilitásának növelése érdekében dialdehid térhálódítószer alkalmazásánál a találmány szerint célszerűen úgy stabilizáljuk a kialakított részecskéket, hogy ismételten dialdehiddel, majd redukáló reagensekkel kezeljük azokat. A találmány szerinti előnyös redukáló reagensek az alkálifémek bórhidridjei, illetve a hidrogén-peroxid. A találmány szerinti eljárás másik változatánál formaldehid térhálósítószert alkalmazunk és a kialakított részecskéket ismételt formaldehides kezeléssel stabilizáljuk, és lehetővé teszi a végtermék előállítási költségeinek csökkentését a jó minőségi jellemzők megtartása mellett. A találmány szerinti előnyös proteolitikus enzimek a tripszin, illetve a kollagenáz. A találmány tárgya a találmány szerinti eljárással előállított, sejttenyésztésre alkalmas olyan mikrohordozó készítmény is, amely szabálytalan alakú, 75-350 |un szemcseméretű, 1,03-1,15 g/cm3 sűrűségű zselatin-blokkpolimer részecskékből áll. A találmány szerinti mikrohordozó készítmény részecskéinek szabálytalan alakja és sima felülete nagyon alkalmassá teszi a készítményt arra, hogy a sejtek megtapadjanak, fejlődjenek és szaporodjanak rajta. A találmány szerinti mikrohordozó ezenkívül transzparens, ez a tulajdonsága megkönnyíti 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
