201798. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált élesztő előállítására, főként pezsgőgyártáshoz
1 HU 201 798 A 2 A találmány immobilizált élesztő előállítására és ezen alapuló pezsgőgyártásra vonatkozik. A Biotechnology Letters (Vol. 9. No. 5. 339-342 o.) folyóiratban champagne-i módszerrel immobilizált élesztőt alkalmaző pezsgőgyártást ismertetnek. Az immobilizált élesztő nátrium-alginát polimer mátrixba van bezárva akként, hogy Saccharomyces cerevisiae f.r. baynus élesztőt nátrium-alginát-oldatban szuszpendálnak és azt kalcium-klorid-oldatba csepegtetik be. A képződő kb. 3 mm átmérőjű gyöngyöket steril vízzel kimossák, pezsgőalapborba helyezik és 109 élesztő/liter koncentrációt állítanak be. Megállapították azt, hogy a szabad és immobilizált élesztőt alkalmazó pezsgőgyártásban a késztermék minőségét illetően nincs lényeges különbség. A pezsgő és habzóbor ismeretes módon úgy készül, hogy az alapborhoz meghatározott mennyiségű cukrot és élesztőt adnak, az erjedés folyamán pedig annyi szénsav szabadul fel, amely a palack belsejében 5-6 atmoszféra nyomást hoz létre. Az erjedés 12-18 °C mellett megy végbe, ezt követően a palackokat rázóállványra helyezik üvegnyakkal lefelé és rázzák, hogy az élesztő üledéke a dugón kicsapódjon. A rázás hosszadalmas művelet, mivel minden palackot különkülön több napon keresztül kell így kezelni. A rázási művelet befejeztével a dugóra lerakódott élesztőüledéket kiseprőzéssel távolítják el úgy, hogy a palack nyakát -10 °C-os sós lébe merítik, így az üledék a palackba belefagy és a fejlődött C02 nyomása alatt eltávolítható. A 2 432 045 lsz. francia szabadalom szerint előnyös, ha az áterjesztő élesztőt polimerbe bezárva immobilizált formában használják fel. Az immobilizált élesztő előállítására poliakrilamid vagy kalcium-alginát polimert alkalmaznak, az élesztő Saccharomyces cerevisiae. Az élesztő eltávolítása a palackokból kényes művelet és arra törekednek, hogy a pezsgőben szabad élesztősejtek ne maradjanak, mivel ezek homályosodást, bortörést (maszkosodást) okoznak. A palackos pezsgőgyártás munkaigényes műveletét részletezi Keller-Érchegyi-Török: „Pálinka, csemegebor, pezsgő” című könyvének Pezsgő című fejezetében. Az immobilizált élesztő eltávolítása a palackból sokkal egyszerűbb művelet, mivel a polimer gyöngyök - amelybe az élesztősejtek be vannak zárva - a palackokból rázás nélkül eltávolíthatók. Az immobilizált élesztő eltávolítása esetén is azonban az a tapasztalat, hogy bár a művelet egyszerűbb, a pezsgőben szabad élesztősejtek maradnak, mivel az immobilizált élesztők szaporulata a gélburkon keresztül a pezsgőalapborba kerül. A találmány célkitűzése az élesztősejtek olyan tökéletesített immobilizációja, ami előnyösen alkalmazható a pezsgőgyártásban. A találmány szerint az élesztőket tartalmazó szemcsék köré sejtmentes réteget alakítunk ki steril körülmények között. A bioaktív magot pedig úgy készítjük elő, hogy csak kevés élesztősejtet immobilizálunk, majd a rögzített sejteket aerob fermentációval a gélszemcsékben úgy szaporítjuk el, hogy a legnagyobb sejtkoncentráció a szemcsék felületéhez közel alakuljon ki. A találmány szerinti eljárás immobilizált élesztő előállítására főként pezsgőgyártáshoz az élesztőszuszpenziónak nátrium-alginát és kalcium-klorid reagensekkel való immobilizálása útján azzal jellemezhető, hogy az adaptált élesztőmasszát előnyösen alkohollal sterilizált nátrium-alginát és kalcium-klorid reagensekkel ismert módon gélbe zárjuk, a bezárt élesztőt levegőztetés mellett a kiindulási sejtszámra számítva legalább két nagyságrenddel nagyobb sejtszámra szaporítjuk, a felületi rétegben felszaporított élesztősejteket tartalmazó szemcséket mosás után steril kalcium-klorid-oldattal telítjük és nátrium-algináttal érintkezésbe hozzuk, a kialakított másodlagos gélburkot pedig kalcium-kloridoldattal stabilizáljuk, majd a szemcséket pezsgőalapborral átmossuk és a pezsgőgyártásban hasznosítjuk. Élesztőként Saccharomyces bayanust pl. (CBS 380 sz.) pezsgőalapborban vagy táptalajon adaptálunk. A gélbezárási műveletekben célszerűen 96 %-os etil-alkohollal forralás közben sterilezett nátrium-alginátot alkalmazunk. A gélbezárásnál 2-8 UO6 sejt/ml sejtszámot használunk a szaporítás kezdetén. Az élesztőszaporításhoz citromsavval savanyított adaptáló táptalajt alkalmazunk és levegőztetés mellett 3*108-2»109 sejt/ml gélkoncentrációt alakítunk ki. A levegőztetés mellett a felületi rétegben szaporított élesztőmasszát bő mennyiségű steril csapvízzel való mosás után steril kalciumklorid-oldattal telítjük és a szemcséket steril környezetben szárítjuk akként, hogy a szemcsék ne tapadjanak össze. A telített szemcséket 0,1 t%-os sterilizált nátrium-alginát-oldattal hígított közegben reagáltatjuk és így laza szerkezetű másodlagos burkot alakítunk ki. A folyadékközegből dekantált szemcséket kalcium-klorid-oldattal stabilizáljuk és pezsgőalapborral átmossuk. A pezsgőgyártásban, főként a palackos pezsgő előállításánál, az erjesztéshez előkészített bort - amely már a tirázs likőrt is tartalmazza - sterilre szűrjük és mind a palackot, mind a dugót sterilizáljuk. Az erjesztés ideje alatt a palackot nem szükséges rázni, sem mozgatni, a kettős burokba zárt élesztőszemcsék az alapborból erjesztés után könnyen eltávolíthatók és az elkészített pezsgő beltartalmi értéke megegyezik a klasszikus módszerrel készített pezsgőével. A pezsgőgyártáson kívül a biomatrix köré kialakított másodlagos burok töltetként más biotechnológiai műveletekben (folyamatokban) is alkalmazható. Alkalmazható minden folyamatban, ahol a rögzített sejtes mátrixból nem juthat élő anyag (sejt) a műveleti közegbe, vagy ahol az elvégzendő biotechnológiai művelet kinetikai paramétereit a tölteten kialakított másodlagos burok érdemlegesen nem befolyásolja. Végül ott is, ahol a matrix kémiai felépítése ezt lehetővé teszi. A másodlagos burokkal ellátott rögzített sejtes töltetek tetszés szerinti mikroorganizmussal alapvetően lerövidíthetik a fermentációs eljárások ún. Downstream műveleteit; alkalmazásuk esetén ugyanis a bioreaktorokba sejtmentes szubsztrátum vihető be és onnan sejtmentes termék távozhat. A találmány szerinti sejtimmobilizálási eljárás például felhasználható bakteriális eredetű fehérjetermészetű anyagok folyamatos előállításánál steril fermen5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
