201798. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált élesztő előállítására, főként pezsgőgyártáshoz

1

HU 201 798 A

2

tációval, így amiláz, kitináz, proteáz, lizozin, lecitináz, toxinok lítikus enzimkomplexek (extracellurális enzimek) előállításához, vagy nagyértékű fehérjék termeltetésénél rögzített állati vagy növényi sejtekkel (monoklonális ellenanyagok, lektinek) stb.

A találmány szerinti immobilizálási technikát és a rögzített élesztőn alapuló pezsgőgyártást a következő kiviteli példákban ismertetjük:

l. Példa

Saccharomyces bayanus tiszta tenyészetét legalább tízszeri átoltással 10 t%-os alkoholkoncentrációhoz adaptáltatjuk. Az adaptáláshoz 0,1 t%-os ammóniumkloridot és 2,5 t% szacharózt tartalmazó pezsgőalapbort vagy a következő összetételű mesterséges táptalajt alkalmazzuk:

2,5 t% szacharóz 0,1 t% pepton 0,5 t% Yeast élesztőkivonat 0,15 t% KH2PO4 0,15 t% NH4CI 10 t% etanol

A táptalajt 5 pH-értékre állítjuk be, majd sterilizáljuk. Az immobilizáláshoz nagy viszkozitású nátriumalginát 2 t%-os steril oldatát alkalmazzuk (Lamitex H-40 vagy Protanal HF-250, gyártja: PROTAN, Dramnen, Norvégia). 100 ml gél készítéséhez 2 g alginátot 2 cm3 etanollal (96 t%-os) 5 percig forraljuk, majd steril desztillált vízben oldjuk. A Saccharomyces bayanus starter kultúrát centrifugáljuk, majd 0,85 t%-os nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, ezután ismét lecentrifugáljuk. A kalciummentesre mosott biomasszát elkeverjük a nátrium-alginát-oldatban. Az alginátban annyi biomasszát keverünk el, hogy az alginát térfogatára nézve a sejtszám a megadott 2—8* 106 sejt/cm3 tartományba essen. A sejtszuszpenziót ezután alkalmas cseppképző eszközzel 100 mM-os kalcium-klorid-oldatba csepegtetjük. A sejtszuszpenzió elkészítése és a cseppképzés ideje nem haladhatja meg az 1 órás időtartamot. A gélbezárt élesztőtömeg 100 mM-os kalcium-klorid-oldatban +4 °C-on 1 hónapig tárolható.

A kialakított szemcséket az adaptáltató tápoldatban - amelyet 0,01 % citromsavval kiegészített csapvízzel készítünk - intenzív levegőztetés mellett szaporítjuk. 48 órás intenzív rázatás vagy kevertetés után a gélszemcsék felületi rétegében 3* 108—2*109 sejt/cm3 biomassza-koncentráció létesíthető. A szemcsék környezetébe került néhányszor 107 sejt/cm3 biomasszát és a tápoldatot mosással távolítjuk el. A mosást a szemcse térfogatához képest tízszeres mennyiségű 0,01 t% citromsavat tartalmazó steril csapvízzel végezzük.

A mosás után a szemcséket ismét telítjük 100 mM- os steril kalcium-klorid-oldattal, majd a mosófolyadékot dekantáljuk és a szemcséket 20 °C-on áramló steril levegővel szárítjuk.

Alkoholos száraz sterilezéssel 0,1 %-os nátrium-alginát-oldatot készítünk elő a szemcsék térfogatára számítva legalább százszoros térfogatban és a szemcséket az áramoltatott híg alginátoldattal érintkeztetjük, és így kalcium-alginát laza szerkezetű burkot állítunk elő legalább 5 perc alatt. A kalcium-alginát héj képzése után a rendszert desztillált vízzel legalább kétszeres térfogatra hígítjuk és az oldat legalább 3/4 részét dekantáljuk.

A második gélburok stabilizálását 100 mM-os steril kalcium-klorid-olattal végezzük, majd 101% alkoholt tartalmazó kalcium-klorid-oldattal öbltünk kevergetés közben. Végül a szemcséket térfogatukra számítva 1-3-szoros térfogatnyi pezsgő-alapborral mossuk át.

2. Példa

Az 1. példa szerint előállított szemcséket pezsgőkészítésre alkalmazzuk. Az erjesztéshez előkészített tirázs likőrt is tartalmazó bort sterilre szűrjük és 2,5 % szacharózt tartalmazó alapbort a szemcsék felhasználásával erjesztjük. Az erjesztés alatt a palackokat sem rázni, sem mozgatni nem szükséges, utána a palackokat degorzsáljuk, likőrözzük a hagyományos gépsoron. A pezsgőpalackokban homályosodás vagy bortörés nem lép fel és már egy hónapos erjesztési idő után a pezsgő beltartalmi értékei jó egyezést mutatnak az ugyanolyan márkájú pezsgővel (cukor 1,25 %, alkohol 12,24 %, összes savtartalom 0,525 %, illósav 0,39 %, kénessav 1/35, extrakt tartalom: 2,24 %). A mért adatok a következők:

k-kontroll

t-találmány szerinti rögzített sejtes

Erjedési napok

Hőmérséklet

°C

Alkohol

tf%

Cukor

g/liter

t

17

11,29

28,7

k

17

11,46

25,6

t

16,5

11,47

25,2

k

16,5

11,73

18,7

t

15

11,79

20,9

k

15

11,97

15,5

t

15

12,09

19,1

k

15

11,95

14,7

t

20.

11,64

19

k

20.

11,85

15,1

t

71.

12,28

9,25

k

71.

12,65

5,0

3. Példa (összehasonlító)

Kísérletet végeztünk arra vonatkozóan, hogy a pezsgőerjesztés körülményei között (18 *C-on) hogyan viselkednek az ismert módon, illetve a találmány szerint immobilizált élesztősejtek. 10 gramm rögzített élesztőt felszaporítottunk, majd ennek felét eljárásunk szerint elláttuk másodlagos burokkal.

Vizsgáltuk, hogyan viselkedik két azonos sejtszámú rendszer, ha a gyöngyből az oldat felé irányuló sejtszaporodást fizikailag meggátoljuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

3