201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B dattal eluáljuk, amely 20 mmól trisz.HCl-t, 100 mmól nátrium-kloridot és 0,1% (térf/térf.) 2- merkapto-etanolt tartalmaz, s pH-ja körülbelül 7,5. Megfelelő térfogatú frakciókat szedtünk, amelyeknek vizsgálatát SDS-PAGE és analitikai HPLC alkalmazásával végezzük el és meghatározzuk e frakciók vírus ellenes aktivitását. A legtisztább frakciókat egyesítjük. Általában helyes, ha a fenilgyanta oszlopon történő kromatográfia után kapott interferon tartalmú oldatot koncentráljuk. Általában az is kívánatos, ha az interferon tartalmú oldatot ebben a lépésben akkor koncentráljuk, amikor még nem végeztük el a kiegészítő hidrofób oszlopos kromatografálást. Az oldat protein koncentrációját Coomassie blue módszerrel határozzuk meg. Ha a protein koncentráció 0,2 mg/ml-nél alacsonyabb, előnyös, ha az oldatot ultraszűréssel—a membrán kizárási molekulatömege 10.000 — bekoncentráljuk. További koncentrálást úgy érünk el, ha az oldathoz ammónium-szulfátot adunk 40-60% telítésig, miközben 5-10 percig keverjük az oldatot. A szuszpenziót jégfürdőben állni hagyjuk és ezután a centrifugálássaJ gyűjtjük össze a csapadékot. A csapadékot 20 mmól trisz.HCl, 500 mmól nátrium-klorid és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatban — pH körülbelül 7,5 — oldjuk fel, amelyet előzőleg olyan szűrőn szűrünk át, amelynek kizárási molekulatömege 10.000. A koncentrált oldatot 0,2 p,-os szűrőn szűrjük, előkészítvén a következő tisztítási lépéshez. A kis és nagy molekulatömegű szennyező anyagokat, a hasadt és aggregálódott gamma interferont egy véső kromatográfiás tisztítási lépésben távolítjuk el oly módon, hogy az előző feldolgozási lépésnél kapott gamma interferon tartalmú oldatot gélszűrőre visszük. A hidrofil gélszűrő úgy viselkedik, mint molekula-szita, amely elkülöníti a megfelelő méretű frakciókat az oldatban lévő nagyobb és kisebb molekulatömegű szennyező anyagoktól. Különösen előnyösen alkalmazható a térhálós dextrán alapú gél, amelynek márka jele Sephadex G-100, gyártja a Pharmacia Fine Chemicals. A gyanta 4.000- 150.000 molekulasúly tartományban frakcionálja a globuláris proteineket és peptideket és 1.000- 100.000 molekulatömeg tartományban a poliszacharidokat. Más olyan gyanták is használhatók, amelyeknek kizárási molekulatömege proteinekre 1.000- 200.000 tartományban van. A Sephadex G-100 oszlopot 20 mmól trisz.HCl, 500 mmól nátrium-klorid és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú puffer oldattal (pH körülbelül 7,5) egyensúlyozzuk ki. Az adszorbeált anyagot a pufferrel eluáljuk és megfelelő frakciószedést alkalmazunk. Minden frakcióban meghatározzuk a protein koncentrációt Coomassie blue módszerrel. A frakciókat SDS-PAGE és antivirális aktivitásuk alapján egyesítjük. Egy másik módszer szerint az ammónium-szulfátos koncentrálási lépésnél kapott csapadékot feloldhatjuk egy 20 mmól nátrium-foszfátot, 500 mmól nátrium-kloridot és 0,1% (térf/térf.) 2-merkaptoetanolt tartalmazó puffer oldatban (pH körülbelül 7,5). A gamma interferon tartalmú oldatot felvisszük Sephacryl S~2Q0 géllel töltött oszlopra, 15 amelyet előzőleg ugyanezen pufferrel kiegyensúlyoztunk (a Sephacryl S-200 — a Pharmacia Fine Chemicals márkaje'e — egy olyan agaróz gyanta, amelyet akrilamiddű térhálósítottak). A végső termék egy tiszta, legfeljebb enyhén zavaros oldat, amely színtelen vagy legfeljebb kissé sárgás színű. A termék molekulatömege 17.000-19.500, SDSPAGE-el meghatározva. A tisztított gamma interferont felhasználás előtt pufferrel szemben dializáljuk. Az alkalmas puffer 20 mmól nátrium-foszfátot, 6 mmól L-ciszteint tartalmaz, pH-ja körülbelül 6,8. Egy másik megfelelő puffer 15 mmól nátrium-foszfátot, 8 mmól nátriumcitrátot és 6 mmól L-ciszteint tartalmaz, pH-ja 5,0. Előnyös, ha a dialízist 8 órán át vagy ennél tovább folytatjuk, közben állandóan nitrogént áramoltatunk át a rendszeren, hoy minimálisra csökkentsük az oxidálást. Ha szükséges, a tisztított gamma interferon oldatot a fent leírt módon koncentrálhatjuk. A jelen találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét e példákra korlátoznánk. Referencia példa A GIF143 kifejező vektor szerkesztése A GIF143 expressziós vektort az alábbi eljárással állítjuk elő. A pGIF54 plazmidot (ez a plazmid egyenlő a pGIF4-gyel, amely a GIF146-ot kódoló gént hordozza) a WA802/pGIF54 transzformált dem Esherichia coli törzsből (a törzs nem metilezi a citozint) állítjuk elő hagyományos módszerrel. A pGIF54 5 p.g-ját 20 egység AatlI-vel és 20 egység BglII-vel kezeljük és így egy 600 bp (bázis pár) hosszú DNS fragmentumhoz jutunk, amely a GIF146 gén egy részét és a lacUV5 promotert tartalmazza. Ezután a DNS fragmentum 0,5 jxg-ját 5 egység Avail-vei hasítjuk, s ekkor egy 400 bp hosszú fragmentumot kapunk, amely a GIF146 gén egy részét hordozza. Másrészt, 5 p.g pIN5T4-et emésztünk 20 egység EcoRI-vel és 20 egység BglII-vel, s a kapott DNS fragmentum tetraciklin rezisztencia gént, lpp promotert és a replikáció kezdőpontját tartalmazza. A két DNS fragmentumot és az 1. ábrán szereplő kémiai úton szintetizált linkerből 0,5 p.g-ot (a szintetizálást egy DNS szintetizátorral végezzük; Applied Biosystems 380A) ligáz reakcióval kapcsoljuk össze, s ekkor kapjuk a pIN5T4N143-at, amellyel W3110 sejteket transzformálunk a szokásos módon — például egy ilyen módszert tartalmaz a 63395/1983. számú japán közrebocsátási irat — s ekkor jutunk a W3110/pIN5T4N143 sejtekhez. A következő eljárással bizonyítjuk, hogy a kapott transzformált törzs GIF143 termelő törzs. A W3110/pIN5T4N143 sejteket rázott tenyészetben tenyésztjük 1,5 ml táptalajban, 16,5 mm-es kémcsőben 30 °CX-on (OD<soo = 8). A táptalaj 3% polipeptont, 2% élesztő kivonatot, 2% glükózt, 0,5% KH2P04-et, 0,010% MgS04.7H20-t és 20 |ig/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetből 0,5 ml-t átviszünk egy 1,5 ml-es Eppendorf csőbe és lecentrifugáljuk a sejteket (5 perc; 10.000 ford/perc). A sejt-üledéket 1 mg/ml lizozim és 1 mmól EDTA tartalmú 0,5 ml PBS-ben (0,8% NaCl, 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
