201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B 0,02% KCl, 0,115% Na2HP04, 0,02% NaH2P04) szuszpendáljuk. A reagáltatást 0 °C-on 30 percig végezzük. A sejteket ezután háromszor ismételt fagyasztással-olvasztással tárjuk fel. Ezután 10 percig centrifugálunk 10.000 ford/perc mellett. A kapott felülúszó vírus ellenes aktivitását a 201995/1983. számú japán közrebocsátási iratban foglaltak szerint határozzuk meg. Az eredmény 6.104 egység/ml anti-vírus aktivitás volt. Emellett, az előbbiekkel azonos módon gyűjtött sejteket 200 pl SDS reagens oldatban (10 mmólos foszfát puffer /pH= 7,2/, amely 7 mól karbamidot, 1% SDS-t, 1% 2-merkaptoetanolt tartalmaz) oldjuk fel, majd az oldatot forró vízfürdőben hevítjük 10 percen át. SDS-PAGE (13%-os) segítségével 20 pl anyagot izoláltunk, amelynek protein tartalmát Coomassie blue R250-nel festettük meg. Megállapítottuk, hogy a termék a GIF143 proteinnek felel meg (molekulatömege körülbelül 18 kd). A kitermelés az Escherichia coli össz-proteinjének mintegy 20%-át tette ki. 1. példa A GIF146 kivonása és tisztítása A W3110/pIN5T4 elnevezésű GIF146 termelő törzset levegőztetett, rázott tenyészetben tenyésztjük 24 órán át. A táptalaj 3% polipeptont, 2% élesztő kivonatot, 2% glükózt, 0,5% KH2P04-et, 0,01% MgS04.7H20-t és 20 pig/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetben lévő sejteket klórhexidinglukonáttal elöljük és lecentrifugáljuk (10 perc; 8.000 ford/perc). A W3110/pIN5T4 sejtek nedves súlya 800 g. A sejteket 5,1 liter hűtött, 1 mmól ZnCl2 tartalmú 20 mmólos trisz.HCl pufferben (pH = 7,4; a következőkben „THB” rövidítést használuník) szuszpendáljuk. A szuszpenziót M15 homogenizátorban (gyártja Manton-Gaulin Co., Ltd.) roncsoljuk, jéggel lehűtjük és ezután centrifugáljuk (20 perc; 7.000 ford/perc). A kapott felülúszóhoz annyi 15%-os polietilén-imint (vizes oldat; a következőkben „PEI” rövidítést használunk) adunk — amelynek pH-ját 8,0-ra állítottuk be sósavval—hogy véső koncentrációja 0,75% legyen. A kapott oldatot 10 percig keverjük, majd állni hagyjuk 4 °C-on 2 óra hosszat. A keletkezett csapadékot centrifugálással (20 perc; 7.000 ford/perc) távolítjuk el. A kapott felülúszó 4,7 liter. A felülúszót egy 20 mmólos N-2- hidroxi-etil-piperazinil-N’-3-propán-szulfonát pufferrel (pH= 8,6; EPPS puffer) kiegyensúlyozott QAE Sephadex A-25 (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopra visszük fel, majd a kapott nem-abszorbeált frakciót 0,1% 2-merkapto-etanol (”2- ME”) tartalmú 20 mmólos THB-vel (pH= 7,4) kiegyensúlyozott CM Sepharose CL6B (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopra abszorbeálódott aktív frakciót lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel (0-0,5 mól) eluáljuk. A magas interferon aktivitású frakciókat összegyűjtjük. Az interferon aktivitást a 201995/1983. számú japán közrebocsátási irat szerint határozzuk meg. E frakcióhoz ammóniumszulfátot adunk 50% telítésig. A kisózás után centrifugáláj következik 20 percig, 7.000 ford/perc mellett. A kapott csapadékot 20 mmólos nátrium-foszfát pufferben (pH = 7,4; a következőkben „20 mM 17 PBS rövidítést használunk) oldjuk fel. A puffer 0,3 mmól NaCl-t és 0,1% 2-Me-t tartalmaz. Az oldatot ugyanezen pufferrel kiegyensúlyozott Sephacryl S-200 (gyártja Pharmacia Co., Ltd.) oszlopon kromatografáljuk. Az eljárással 298 mg GIF146 polipeptidet kaptunk, mint végső tisztított terméket (az interferon specifikus aktivitása: 1,6-1.7.106 egység/mg). A polipeptid SDS-PAGE analízis szerint az anyag 99%-osnál nagyobb tisztaságú és ugyanezen SDS-PAGE vizsgálatban a sáv helyzete ugyanolyan volt, mint a bomlatlan GIF146 polipeptidé. Ezenfelül aminosav analízissel megállapítottuk, hogy a kapott polipeptid aminosav szekvenciája megegyezik az I képlet szerinti aminosav szekvenciával. Ez mutatja a jelen találmány szerinti tisztítási módszer eredményességét. Ha az előbbiekben leírt tisztítási eljárásban használt Sephacryl S-200 helyett Sephadex G-100- at (gyártja: Pharmacia Co., Ltd.) használunk, hasonló eredményeket kapunk. 2. példa A GIF143 kivonása és tisztítása W3110/pIN5T4N143 sejteket (lásd a referencia példát) tenyésztünk ugyanúgy, ahogy azt az 1. példában leírtuk. A sejteket klórhexidin-glukonáttal elöljük és összegyűjtjük. A nedves sejt-tömeget (300 g) 2,1 liter 3 mmól ZnCl2 tartalmú 20 mM THB (pH = 7,4) oldatban szuszpendáljuk, homogenizátorban roncsoljuk, majd centrifugáljuk (20 perc; 7000 fordulat/perc). A kapott felülúszót PEI-vel kezeljük, ugyanúgy, ahogy az 1. példában, s így 1.000 ml felülúszóhoz jutunk. A folyadékot 0,1% 2-ME tartalmú 20 mM THB-vel (pH= 7,4) kiegyensúlyozott CM Sepharose CL6B oszlopra adszorbeáljuk, majd lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel, 0,1-0,8 mól közt végezzük a leoldási. Az aktív frakciót az eredeti térfogat tízszeresére hígítjuk 0,1% 2-ME tartalmú 20 mM THB-vel, az oldatot ugyanezen pufferrel kiegyensúlyozott CM Toyopearl (gyártja Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopra abszorbeáljuk, majd 0,1-0,8 mól tartományban lineáris nátrium-klorid koncentráció grádienssel eluáljuk. Az interferon aktivitású frakciókat egyesítjük, hozzáadunk ammónium-szulfátot 20% telítésig, majd Butyl Toyopearl (gyártja Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopon folytatjuk át. Az oszlopon átfolyó frakciókat leszedjük és desztillált vízzel szemben dializáljuk. Végső termék gyanánt 396 mg proteint kapunk (az interferon specifikus aktivitása: 4.8.106 egység/mg protein). Aminosav analízis és SDS-PAGE eredményeként — miként az 1. példában — azt találtuk, hogy a kapott polipeptid (GIF143) 99%-osnál nagyobb tisztaságú és aminosav szekvenciája megegyezik a fenti III képlet szerinti aminosav szekvenciával. Ezenkívül az extrakciós lépés folyamán hozzáadott cink vegyületet még atomabszorpciós spektrofotometriával sem lehetett kimutatni. 3. példa I. Sejt termelés, protein elválasztás és kicsapás polietiléniminnel Rekombináns gamma interferont tartalmazó inaktivált E.coli (W3110/pIN5T4) sejteket centrifu-18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
