201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B matografálást alkalmaz. Egy további hasznos eljárás a protamin-szulfátos kicsapás. A nukleinsavak eltávolítása után a gamma interferont tartalmazó keveréket az első proteáz eltávolítás! lépésnek vetjük alá. A legegyszerűbb módja a proteázok eltávolításának, ha a nukleinsav eltávolítási lépésből származó felülúszót anioncserélő gyantán kromatografáljuk. Kvaterner amino-etil, vagyes amin vagy más intermedier bázisos gyanta vagy gyengén bázisos gyanta, mint a p-amino-benzil-cellulóz különösen jól használható. A kvaterner amino-etil gyanta igen alkalmas anioncserélő. A kvaterner amino-etil csoportot hozzá lehet kapcsolni térhálós dextrán, cellulóz, agaróz vagy akril hordozóhoz. A felülúszó folyadék pH-ját 8,7 ±0,5, előnyösen ±0,1 értékre állítjuk be nátrium-hidroxiddal vagy valamilyen más alkalmas bázissal. Az oldat vezetőképességét úgy állítjuk be ionmentes víz hozzáadásával, hogy 10 mS alatt, előnyösen 4-8 mS tartományban legyen. A kioldó puffer 20 mmól nátrium-4-(2-hidroxietil)-l-piperazin-propán-szulfonátot és 0,1% (tértytérf.) 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A puffer pH-ját körülbelüól 8,7-re állítjuk be nátrium-hidroxiddal vagy más bázissal. Más alkalmas pufferekkel — ugyanezen pH tartományban — is helyettesíthetjük a piperazin-puffert és más antioxidánst is használhatunk a 2-merkapto-etanol helyett. A kvaterner amino-etil-oszlopot a puffer oldattal először kiegyensúlyozzuk, rávisszük a gamma interferon tartalmú oldatot és az adszorbeált anyagot ugyanezen pufferrel oldjuk le. A leoltott protein oldat első kétharmadát, azaz az eluátum első kétharmad térfogatrészét egyesítjük és ezt visszük át a következő tisztítási lépésbe. Az eluátum visszamaradt egyharmadát újra kromatografálhatjuk ugyanazon — hasonló módon kiegyensúlyozott — oszlopon. Az átfolyt protein oldat első kétharmadát újra egyesítjük. A visszamaradt oldatot újra feldolgozhatjuk azonos módon. Mint előbb, a protein koncentráció meghatározását Coomassie blue módszerrel végezzük el. Egy tetszés szerinti koncentrálási lépést vezethetünk be a tisztítás e pontjánál. Egyik egyszerű módja az oldat koncentrálásának az ammónium-szulfátos kicsapás. A kvaterner amino-etil oszlop eluátumát egy 0,2 p,-os szűrőn átszűrjük és keverés közben, 5-10 perc alatt ammónium-szulfátot adunk hozzá 40-60% telítésig. A szuszpenziót több órán át állni hagyjuk jégfürdőben. A csapadékot ezután centrifugálással gyűjtjük össze, amelyet körülbelül -20 °C-on tárolhatunk, amíg a további feldolgozásnál szükség lesz rá. Amikor szükséges, a csapadékot feloldjuk 20 mmól trisz.HCl és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatban — körülbelül 7,5 pH mellett — amelyet előzőleg átszűrtünk olyan szűrőn, amelynek kizárási molekulatömege 10.000. Az oldat vezetőképességét körülbelül 3-5 mS-re csökkentjük azáltal, hogy hozzáadunk 10 mmól trisz.HCl és 0,1% 2-merkapto-etanol tartalmú oldatot (az oldat pH-ja körülbelül 7,5). Az oldatot 0,2 |x-os szűrőn átszűrjük és ezzel készen áll a további feldolgozásra. Más pufferek is alkalmasak arra, hogy ugyanezen pH tartományban helyettesítsék a trisz.HCl-t 13 és a merkapto-etanol helyett is használhatunk más antioxidánst. Az oldatban lévő pozitív töltésű proteázokat és más proteineket az eljárás következő lépésében távolítjuk el, s ezt legegyszerűbben kationcserélő gyantával végezhetjük el. Kiváló eredményeket kaptunk karboxi-metil kationcserélő gyantával (a karboxi-metil csoport térhálós dextránhoz, cellulózhoz, agarózhoz vagy akril hordozóhoz van kapcsolva). Az előző lépésből származó oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be sósavval vagy más alkalmas savval. Az oldathoz 2-merkaptoetanolt vagy más megfelelő antioxidánst adunk körülbelül 0,1%-os (térf/térf) koncentrációban. Ugyancsak hozzáadunk 0,1% (tértytérf) 2-merkapto-etanol tartalmú ionmentes vizet, hogy vezetőképességét 20 mS alá vigyük, lehetőleg 3-5 mS közé. Az oldatot 0,2 (xs-os szűrőn átszűrjük és így készítjük elő a kromatografáláshoz. A kationcserélő gyantával töltött oszlopot megfelelő pufferrel, például 20 mmól trisz.HCl-t és 0,1% 2-merkapto-etanolt tartalmazó oldattal (pH = 7,5) egyensúlyozzuk ki. Az oszlop kiegyensúlyozása úgy történik, hogy két-háromszor mossuk a kiegyensúlyozó pufferrel és ezután visszük rá a gamma interferon tartalmú oldatot. Az oldat elucióját 13-15 oszlop-térfogatnak megfelelő kiegyensúlyozó pufferben oldott nátrium-klorid grádienssel végezzük. A pufferben a nátrium-klorid tartalom 0-tól maximum 0,5 mólig nő. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, gél-elektroforézissel (SDS-PAGE) és analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, majd megmérjük vírus ellenes aktivitását. A legtisztább frakciókat elegyítjük és ezt használjuk a további feldolgozásnál. Az alacsony tisztaságú interferon tartalmú frakciókat kicsaphatjuk ammónium-szulfáttal, 40-60% telítéssel. A csapadékot visszaoldjuk, szűrjük és karboxi-metil oszlopon kromatografáljuk úgy, ahogy az előzőekben leírtuk. Az újbóli kromatografálásnál gyűjtött frakciók analízise után a legtisztább frakciókat egyesítjük a karboxi-metil oszlopról először eluált frakciókkal. Ha SDS-PAGE vagy más alkalmas módszer révén nagy molekulatömegű hidrofób szennyező anyagok jelenlétét észleljük a tisztítási eljárásnak ebben a szakaszában, az eluátumból az adott esetnek megfelelő kromatográfiás eljárással távolítjuk el az ilyen szennyezéseket. Úgy találtuk, hogy afenil gyanta szolgáltat kielégítő eredményeket. Oktil és butil gyanták szintén használhatók. Az előző feldolgozási lépésben kapott oldatot 0,2 jx-os szűrőn megszűrjük és nátrium-kloridot (0,5-0,75 mól) adunk a szűrlethez, hogy vezetőképességét körülbelül 50-75 mS-re növeljük. A puffer oldat 20 mmól trisz.HCl-t, 0,1% (tértytérf.), 2-merkapto-etanolt és 500-850 mmól, előnyösen 500-700 mmól nátrium-kloridot vagy más sót tartalmaz, hogy vezetőképessége a megfelelő tartományban legyen. Az oszlopot előzőleg kiegyensúlyozzuk a pufferrel, majd rávisszük a szűrletet. Körülbelül 2-4 oszloptérfogatnak megfelelő puffer oldatot adunk az oszlopra. Az adszorbeálódott anyagot ezután 5- 10 oszlop töltetnek megfelelő mennyiségű olyan ol14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
