201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
Hü 201775 B lasztásoknál alkalmazott gyanták és használatuk sorrendje a következő: 1) anioncserélő gyanta; 2) kationcserélő gyanta; 3) molekula szita. A kromatográfiás elválasztásokon felül a következő eljárások alkalmazása hasznos: kicsapás, szűrés, koncentrálás és dializálás. Egyik előnyös eljárásban a gamma interferont tartalmazó keveréket az alábbi kezeléseknek vetjük alá: 1) nukleinsav eltávolítás polietilén-iminnel való kicsapással; 2) a negatív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása gyengén bázisos anioncserélő gyanta használatával; 3) a pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása gyengén savas kationcserélő gyantával; 4) a hasadt és aggregálódott interferon és a sejt fragmentumok eltávolítása molekula szita segítségével. Hasznos kiegészítő eljárások: szűrés minden lépés után, a 3. és/vagy 4. lépés után koncentrálás, az 5. lépés után dialízis. Ezzel az új eljárással rendszeresen termelünk legalább 95% tisztaságú gamma interferont 5%-ot meghaladó kitermeléssel. A jelen találmánynak egyik fontos sajátossága az új tisztítási séma, amely minden esetben használható gamma interferonra, a számos módszer közül bármelyikkel is volt előállítva, akár szövet tenyészetben szaporított humán sejtekből, akár vérmintákból gyűjtött leukocitákból, akár az ezen a szakterületen jól ismert klónozási módszerekkel. A tisztítási séma különösen az E. coli sejtekből nyert rekombináns gamma interferon tisztítására alkalmas. A sejteket a standard módszerek egyikével inaktiváljuk, ilyen a kémiai elölés módszere, például klór-hexidin-glukonáttal. Az inaktivált sejteket lecentrifugáljuk, pufferben reszuszpendáljuk és homogenizáljuk. A gamma interferon tartalmú sejtek homogenizálására alkalmas módszer a nagy nyíróerővel való feltárás Manton-Gaulin homogenizátorban. Az elroncsolt sejtek komponenseit centrifugálással csapadékra és felülúszóra különítjük el. Az itt kapott felülúszó megfelelő forrása az interferonnak, ahonnan a jelen találmány szerint izoláljuk és tisztítjuk. A lizált sejt szuszpenzió proteineket, lipideket, szénhidrátokat, nukleinsavakat és oldhatatlan sejt törmelékeket tartalmaz. Szokásos eljárásokkal a sejt vízben oldhatatlan alkotórészeit a sejt vízben oldódó frakcióitól elkülönítjük, ezek a felülúszóban maradnak. Néha előnyös, ha a gamma interferonnak a sejtekből való kivonása előtt bizonyos előzetes feldolgozási lépéseket alkalmazunk, például olyan módszereket, amelyek csökkentik az interferon degradálódását az eljárás folyamán. Bármilyen ilyen előzetes eljárás alkalmazható, feltéve, ha ezek nem zavarják az itt leírt tisztítási sémát. A soklépéses tisztítási sémával a tiszta interferont nagyobb kitermeléssel állítjuk elő, biológiai aktivitásának megtartása mellett. Az elválasztási 11 lépések szekvenciája nagyon lényeges és meghatározó abból a szempontból, hogy a találmány szerint kívánt eredményeket elérhessük. Az interferont tartalmazó keverékből a következő sorrendben távolítjuk el a szennyezéseket: a) nukleinsavak eltávolítása; b) a negatív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása; c) a pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek eltávolítása; d) a kis és nagy molekulatömegű szennyező anyagok, az interferon törmelékek és interferon aggregátumok eltávolítása. Jelenleg nem ismerjük az okát, de a szennyező anyagoknak a megállapított sorrendben való eltávolítása határozza meg, hogy nagy kitermelést érjünk el a tisztított gamma interferonnál amellett, hogy biológiai aktivitását is megőrzi. A különböző típusú szennyező anyagok eltávolítására használt egyedi lépések rutin módszerek és a szakterületen ismertek. Mivel durva feldolgozási körülmények között a gamma interferon hajlamos inaktív formákká való átalakulásra, egyrészt a molekula hasadása, másrészt aggregálódása következtében, azok a tisztítási lépések az előnyösek, amelyeket kíméletes feldolgozási módszerekkel lehet végrehajtani. A találmányban ezenkívül olyan specifikus feldolgozási lépéseket és körülményeket is leírtunk, amelyekről azt találtuk, hogy minimálisra csökkentik az interferon degradációját, azonban el kell ismerjük, hogy más hagyományos feldolgozási lépésekkel is lehet helyettesíteni a találmányban említetteket, feltéve, ha a szennyezések eltávolításának sorrendje ugyanaz marad, ahogy leírtuk. Ha az ezután következő leírásban másként nem állítjuk, az adott pH-értékektől való eltérés általában ± 0,5 lehet, előnyösebb a ± 0,25, de legelőnyösebb a ± 0,1 eltérés. A vezetőképesség méréseknél az eltérés általában ± 5 mS lehet, de előnyösebb, ha a ±3 mS tartományban marad. A műveleteket 2- 15 °C hőmérsékleti tartományban végezzük. A feldolgozási séma első lépése a nukleinsavak eltávolítását foglalja magába. Az eltávolítást úgy lehet könnyen keresztülvinni, hogy a lizált sejtek keverékének centrifugálás után kapott felülúszójához polietilén-imint adunk. Egy másik megoldás szerint a polietilén-imin oldatot, ha kívánt, a homogenizálás előtt is hozzá lehet adni a sejtekhez. A polietilén-imint lassan, keverés közben adagoljuk, legfeljebb 0,8% maximális koncentrációig. Ezután a keveréket megfelelő ideig, általában 30-90 percig ülepedni hagyjuk. A keveréket ezután lecentrifugáljuk és a felülúszót felfogjuk. Kiváló eredményeket kapunk, ha a polietilén-imint 10%-os (térf/térf.) vizes oldatként adagoljuk és ez a koncentráció elég ahhoz, hogy a polietilén-imin tartalmú oldat végső koncentrációja körülbelül 0,7-0,8%-os (térf/térf.) legyen. Az oldat pH-ja 8as0,5, előnyösen ±0,1 és a hőmérsékletet 2-15 °C között tartjuk. Ennél a lépésnél meghatározzuk a felülúszó protein koncentrációját a standard coomassie blue módszerrel és az előálh'tás minden további szakaszánál ugyanígy járunk el. Egy másik eljárás a nukleinsav eltávolítására hidroxilapatiton vagy immobilizált PEI-n való kro-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
