201758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kondenzált diazepinonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 Hü 201758 B 6 hörgőkre, a hólyagra és a vastagbélre kifejtett görcsoldó hatást is mutat. A vegyületek gyógyászati alkalmazása szempontjából különösen fontos, hogy rendkívül kedvezően alakul egyrészt a szívritmust fokozó előnyös hatás, másrészt az antikolinerg hatású gyógyszerek esetében csaknem mindig megjelenő, nemkívánatos, a pupillatágulatra, továbbá a könny-, nyál- és gyomorsav-szekrécióra gyakorolt hatás viszonya. Az alábbi vizsgálatok eredményei bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek e tekintetben meglepően előnyös tulajdonságúak. A) A muszkarin receptorokhoz való kötődés vizsgálata Az 7Cm értékek meghatározása in vitro kísérleti körülmények között A szerveket 180-220 g testtömegü, hím Sprague-Dawley patkányokból nyertük. A szív, az állkapocs alatti szövetek, valamint az agykéreg kivétele után azokkal minden műveletet jéghideg HEPES-sósav pufferelegyben (pH = 7,4; 100 pM nátrium-klorid; 10 pM magnézium-klorid) végeztünk. A szívet egészben vettük ki, ollóval feldaraboltuk, és mint a többi szervet is, Potter-féle berendezésben homogenizáltuk. A különböző szervekből készített homogenizátumokat a receptorkötödési vizsgálatokhoz az alábbi arányban hígítottuk: Szív 1:400 Agykéreg 1:3000 Állkapocs alatti szövetek 1:400 A szervhomogenizátumokat ezt követően a radioaktiv ligandum meghatározott mennyiségével és a nem radioaktív vizsgálati anyag higítási sort képező mennyiségeivel Eppendor-centrifugacsövekben, 30 °C hőmérsékleten, 45 percen át inkubáltuk. Radioaktiv ligandumként 0,3 nM [3H]-N-metil-szkopolamint (3H—NMS) használtunk. Az inkubálási idő leteltével jéghideg pufferoldatot adtunk a mintához, majd szívatással szűrtük, a szűrőt hideg pufferoldattal átöblítettük és meghatároztuk a radioaktivitását. Az igy kapott érték az összes - specifikusan és nem specifikusan kötött - 3H-NMS mennyiségét mutatja. A specifikus kötődés mértéke az 1 pM kinuklidinil-benzilát jelenlétében megkötött radioaktivitásból adódik. Minden esetben több párhuzamos mérést végeztünk. A nem radioaktív vizsgálati anyag IC50 értékét grafikusan határoztuk meg. Ez az érték a vizsgálati anyagnak azt a koncentrációját jelenti, amely a 3H-NMS specifikus kötődését a különböző szervekből nyert muszkarin receptorokhoz 50%-ban gátolja. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók. B) A muszkarin antagonists hatás funkcionális szelektivitásának vizsgálata A muszkarin antagonista tulajdonságú hatóanyagok gátolják a külső eredetű agonisták, illetve a kolinerg idegvégződéseknél felszabaduló endogén anyag, az acetilkolin hatását. Az alábbiakban ismertetjük azokat a módszereket, amelyekkel a kardioszelektiv muszkarin antagonista hatás behatárolható. In vivo módszerek: A vizsgálatok célja, hogy bizonyítsuk a muszkarin antagonista hatás szelektivitását. Minden olyan hatóanyaggal, amelyet az in vitro tesztek alapján kiválasztottunk, elvégeztük az alábbi vizsgálatokat: 1. M1/M2 szelektivitás patkányokon 2. Nyálelválasztást gátló hatás patkányokon 3. Az acetilkolin hólyagra, hörgőkre és szivfrekvenciára gyakorolt hatásénak gátlása tengerimalacokon. 1. M1/M2 szelektivitás vizsgálata patkányokon A módszert Hammer és Giachetti [Life Sciences 31, 2991-2998 (1982)] írták le. A kísérletekhez hím THOM patkányokat használtunk. A vizsgálati anyag növekvő dózisainak intravénás befecskendezését követően, 5 perc múlva vagy a jobb oldali bolygóideget ingereltük elektromosan (frekvencia: 25 Hz; impulzusszélesség: 2 msec; időtartam: 30 sec; feszültség: szupramaximális), vagy McN-A-343 0,3 mg/kg dózisát kapták a kísérleti állatok intravénásán. Meghatároztuk a vagus (bolygóideg) ingerlésével kiváltott bradikardiát, valamint az McN-A-343 okozta vérnyomás-növekedést. A kísérleti vegyületnek azt a dózisát, amely a vagus ingerlésével kiváltott bradikardiát (M2), illetve a vérnyomás-növekedés mértékét (Mi) 50%-kal csökkenti, grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 2. Nyálelválasztást gátló hatás vizsgálata patkányokon A vizsgálatot Lavy és Mulder módszerével [Arch. Int. Pharmacodyn. 178, 437-445 (1969)] végeztük, miszerint 1,2 g/kg uretánnal altatott, hím THOM patkányoknak a kísérleti anyag növekvő dózisait adtuk intravénásán, majd a nyálfolyást 2 mg/kg szubkután adott pilokarpinnal váltottuk ki. A nyálat szűrőpapírral itattuk fel, és a kapott folt kiterjedését 5 percenként planiméterrel meghatároztuk. A kísérleti anyagnak azt a dózisát, amely a nyél térfogatát 50%-kal csökkenti, grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
