201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
13 HU 201 682 B 14 mun-szorbens vizsgálattal (ELISA) vizsgáljuk, Dame és munkatársai [Science 225, 593 (1984)] módszere szerint. A mikrotitrátor lemezek lyukainak bevonására marha-szérumalbuminhoz (BSA) kapcsolt szintetikus peptid antigént használunk. 50 pl (0,1 pg) 0,01 mól/l koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) (PBS) hígított vizsgálandó antigént pipettázunk a políszlirol mikrotitrátor lemezek (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA, USA) lyukaiba, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten (kb. 22. °C) tartjuk. A lyukak tartalmát ezután leszivatjuk, gátló pufferral (BB, amelynek összetétele: 1,0% BSA, 0,5% kazein, 0,005% timerszol és 0,0005% fcnolvörös PBS-ben) töltjük fel és 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az egérszérumot sorozathígításos módszerrel BB-vel hígítjuk, és minden egyes lyukba 50 pl-t mérünk belőle. A lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, majd a lyukakat leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-0,05% Twecn 20 (PBS-TW20) eleggycl és 50 pl, 10% hővel inaktivált emberi szérumot tartalmazó PBS-sel 1/500- szorosára hígított kecske anti-egér IgG-vel konjugált torma-peroxidázt. (H+I) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) mérünk az egyes lyukakba. Egy óra elteltével a lyukak tartalmát leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-TW20-szal és 150 pl szubsztrátot [1 mg 2,2’-azino-di(3-ctil-benztiazolin-6-szulfonsav)/l ml 0,005% hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,1 mól/l koncentrációjú cilrát-foszfát puffer, pH 4,0, a hidrogén-peroxidot közvetlenül felhasználás előtt adj uk a pufferhez] mérünk minden egyes lyukba. Egy óra elteltével 414 nm-cn meghatározzuk az abszorpciót, ELISA lemez-leolvasó (Titertek Multiskan, Flow Laboratories Inc., McLean, VA) segítségével. Az R16tet32, R32tet32 és R48tct32 polipeptidek mindegyike olyan antitest-termelést váltott ki, amely ELISA tesztben reakcióképes volt. Az R16tet32, önmagában alkalmazva, kevésbé volt immunogén tulajdonságú, mint az R32tet32 vagy az R48tet32. Az alum és a CFA növelte mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein immunogén tulajdonságát, és még 102 000-en felüli titer esetén is észlelhető antitest legalább egy vizsgálatban. 10 10. példa Antitest-válasz - IFA A 9. példa szerinti antiszérum vizsgálataink szerint erősen reagált autentikus P. falciparum CS-proteinnel, indirekt immunofluoreszcens antitest vizsgálatban (IFA). P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva és P. gallinaceum elleni reaktivitást nem tapasztaltunk. Az R32tet32- vel szembeni antiszérum csekély reaktivitást mutatott P. berghei ellen. Ez az eredmény összhangban van Hockmeyerés munkatársai [Proc. 3d Int’l. Symp. Immunobioi. Proteins Peptides, szerk. Atassi, M. Z., Plenum New York (nyomdában)] azon megfigyelésével, miszerint a P falciparummal szembeni bizonyos Mab-ok reagálnak a P. berghei sporozoitokkal IFA vizsgálatban. A sporozoitokat fertőzött moszkitók nyálmirigyéből preparáljuk, lényegében Bosworth [J. Párásítói. 61,769 (1975)] módszere szerint, sóoldattal vagy 0,5% BSA-t tartalmazó Medium 199-cel (GIBCO) hígítjuk, hemacitométert alkalmazva számoljuk és 2000-5000 sporozoit/10 pl értékre hígítjuk. 10 pl-es alikvotokat mérünk a többlyukú, nyomott IFA-lemez minden egyes lyukába, szobahőmérsékleten, levegővel szárítjuk és -80 "C-on tároljuk. Az IFA-vizsgálatot azzal kezdjük, hogy 20 pl térfogatú, BB-vel 1/100-szorosára hígított szérumot szélesztünk a szárított sporozoitokat tartalmazó IFA-lemez lyukaiba. Nedves kamrában, szobahőmérsékleten, 20 percen át végzett inkubálás után a szérumoldatokat leszivatjuk és a lyukakat 2 csepp PBS-sel mossuk. Az egyes lyukakba ezután 20 pl, BB-vel 1 :40-szeresére hígított, fluoreszcein-izotiocianáthoz kapcsolt kecske anti-egér antitestet (Kirkegard és Perry, Gaithersburg, MD, USA) adunk. Szobahőmérsékleten 20 percen át tarló inkubálás után a lyukakat ismét kimossuk 2 csepp PBS-sel, glicerinben tárgylemezre helyezzük és UV-fénybcn 500-szoros nagyítással meghatározzuk a fluoreszcenciát. 11. példa CSP-reakció R16tet32-vel, R32tet32-vcl és R48tet32-vel immunizált egerekből származó szérumok erős CSP-pozilív reakciókat adnak, amint az az 1. táblázat adataiból látható. Adjuváns nélkül alkalmazva csak az R16tct32-re nem termelődik olyan antitest, ami pozitív CSP-rcakciót adna, míg CFA-val vagy alummal együtt adva mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein olyan antitest-termelést indukál, amely erős CSP-reakciókat ad. 1. táblázat: R16tet32, R32tet32 és R48tet32 elleni antiszérum CSP-reaktivitása Adjuváns Antiszérum R16tet32 R32tet32 R48tet32 — 0/25(—) 17/25(2+) 21/25(4+) CFA 23/25(4+) 21/25(4+) 21/25(4+) alum 25/25(4+) 25/25(4+) 16/27(2+-4+) A CSP-reakciókat lényegében Vanderberg és munkatársai [Mii. Med. 134 (Supp. 1), 1183 (1969)] módszere szerint hajtjuk végre. 5 pl mintát, amely 500-1000 moszkitó nyálmirigyből származó P. falciparum sporozoitol tartalmaz Medium 199-ben újraszuszpendálva, mikroszkóp tárgylemezen 5 pl szérummal keverünk össze, vazelinnal szegélyezett zárólemezzel lefedjük és 37 'C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakciót fázis-kontraszt mikroszkóppal értékeljük ki, 400-szoros nagyítást alkalmazva. Minden egyes szérum-mintában 25 véletlenszerűen választott sporozoitot vizsgálunk meg, és feljegyezzük a CSP-poziu'v organizmusok számát. A CSP- reaktivitás mértékét - Vanderberg és munkatársai fenti idézett módszere szerint meghatározva-zárójelben tüntetjük fel. A (-) érték azt jelenti, hogy nem észlelhető CSP-reaktivitás; (2+) szemcsés csapadék megjelenését jelenti a sporozoitok felületén; (4+) hosszú, fonalszerű filamentum megjelenését jelzi a sporozoitok egyik végén. A normál egérszérum, vagy a csak CFA-val immunizált egérből származó szérum nem vált ki kimutatható mértékű CSP-reakciót, párhuzamos vizsgálatokban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
