201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
15 HU 201 682 B 16 12. példa Ilepatocita-blokkolás A 9. példa szerinti szérumokat in vitro invázió-gátlás szempontjából is megvizsgáljuk, az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük. 2. táblázat: P. falciparum sporozoitok HepG2 - A16 i hepatoma sejtek elleni inváziójának gátlása Adjuváns Antiszérum R16 R32 R48 46 95 92 CFA 76 92 94 alum 100 100 96 Az eredmények szerint az R32tct32 és R48tet32 proteinek erősen blokkoló hatású antitestek képződését indukálják, még adjuváns nélkül is. Az R16tet32 kevésbé hatásos erősen blokkoló hatású antitestek kiváltásában, csak alumhoz adszorbeálva fejt ki megfelelő hatást. A fenti eredmény összhangban van az R16tet32-re termelt antiszérum esetén megfigyelt gyenge CSP-reaktivitással és alacsony ELISA-titcrekkel. A sporozoit-invázió gátlásának vizsgálatát tenyésztett sejteken lényegében Hollingdale és munkatársai [J. Immunoi. 32, 909 (1984)] módszere szerint végezzük. Az R16tet32-vel, R32tet32-vel és R48tet32- vel immunizált egerekből nyert szérumot azon képessége szempontjából vizsgáljuk, hogy milyen mértékben tudja meggátolni A P. falciparum sporozoitok invázióját tenyésztett sejtek ellen. A szérumot a tápközeggel hígítjuk és 1 : 20-szoros végső hígításban (térfogat/térfogat) HepG2-A16 sejttenyészethez [(Am. J. Trop. Med. Hyg. 32,682-684 (1983)] adjuk. A tenyészetekhez ezután 12 0(XM0 000 moszkitó nyálmirigyből nyert P. falciparum sporozoitot adunk és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában 37 ‘C- on 3 órán át inkubáljuk, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) öblítjük, metanolban fixáljuk és PBS-sel kétszer öblítjük. Azokat a sporozoitokat, amelyek bejutottak a sejtbe, immunperoxidáz antitest vizsgálattal (IPA) teszszük láthatóvá (Hollingdale és munkatársai fent idézett munkája szerint). Az IPA vizsgálatot úgy végezzük, hogy a fixált tenyészetet először P. falciparummal szembeni Mab-bal (2F1.1, lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) kezeljük, majd torma-peroxidázhoz kapcsolt nyúl anti-egér immun-globulinnal inkubáljuk és 3,3-diamino-benzidinnel megfestjük. A tenyésztett sejtekbe bejutott sporozoitok számát úgy határozzuk meg, hogy megszámoljuk a teljes preparátumban a sejten belüli parazitákat, Leitz mikroszkópot használva, 250-szeres nagyítás mellett, sötétkék színszűrővel. A vizsgálatokat vagy két, vagy három párhuzamos mintát vizsgálva hajtjuk végre, és minden egyes sejttenyészethez azonos számú sporozoitot adunk egy kísérletsorozaton belül. A gátlást a találmány szerinti polipeptidekkel szembeni immunszérum által kifejtett sporozoit-invázió%-os csökkentésével adjuk meg, normál egérszérum kontrollokhoz viszonyítva, ahol a CS-reaktív Mab 2F1.1 100%-os gátlást fejt ki a sporozoit-invázió ellen, 1/20-as hígításban. A találmány szerinti eljárással előállított RLA, R16NS1 és R32NS1 rekombináns polipeptideket is hasonlóképpen vizsgáltuk, ELISA és IFA vizsgálatokkal, és azt tapasztaltuk, hogy azok hasonlóképpen olyan antitestet indukálnák, amely reagál a 16 aminosavból álló szintetikus polipeptiddel, és így pozitív CSP-reakciót adnak. Előnyösek az R32tet32 és R32LA proteinek, viszonylagos homogenitásuk, képződési szintjük és könnyű előállításuk következtében. A szintetikusan előállított vakcinák esetén elsődleges fontosságú, hogy a szintetikus immunogénnel szemben termelődő antitest felismeri-e az autentikus molekulát, és vajon az antitest rendelkezik-e a megfelelő védelem kialakításához szükséges biológiai tulajdonságokkal. Az immunflureszcencia vizsgálat és a CSP-reakció eredménye szerint az E. coliban termelt polipeptidekkel szemben képződő antitest reagál a sporozok felületével, és így felismeri az autentikus CS-proteint. Állatkísérletekben és emberben is kimutatták, hogy a CSP-antitest jelenléte jelentősen összefügg a protektiv immunitással. Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárással előállított proteinek ellen termelődő antitestek gátolják a humán hepatoma sejtek sporozoitok általi invázióját in vitro, igen jelentős. Hollingdale és munkatársai (lásd fent idézett munkájuk) kimutatták, hogy mind a P. falciparum, mind a P. vivax elleni Mab-ok, valamint a fenti maláriafajok ellen immunis emberekből nyert poliklonális szérum is gátolják a sporozoit-inváziót. Ezért a sporozoitok invázió-gátlásának in vitro vizsgálata megfelelő vizsgálati módszert jelent a protektiv antitestek kimutatására. A fent ismertetett vizsgálatok eredményei összességükben azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vakcinát a humán gyógyászatban P. falciparum által okozott fertőzések elleni védelemre használhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns proteinek imm un-válasza Freund-féle komplett adjuvánssal vagy alummal egyaránt növelhető, amint azt ELISA-titerük, felületi reaktivitásuk (IFA és CSP) és sporozoit-inváziót gátló hatásuk vizsgálatakor megállapítottuk. A Freund-féle komplett adjuváns emberben nem használható, mivel lázat okoz, granulomákat vált ki és tuberkulin-túlérzékenységet eredményez. Az alumot jelenleg már bevezetett vakcinákban - például a diftéria és a tetanusz toxoid, valamint az egyik legújabb vakcina, a Hepatitis B esetén - is használják adjuvánsként. Hatékonysága és a humán gyógyászatban régóta tartó biztonságos használata bizonyított. 13. példa Vakcina előállítása A találmány szerinti eljárás értelmében például az alábbi módon készíthetünk vakcinát. 3%-os vizes, pufferolt alumínium-hidroxid-oldathoz (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH 6,8; szűréssel sterilizálva) ugyanezen összetételű pufferben oldva adjuk keverés közben a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet, a pepiidre nézve 100 pg/ml, az AL3+-ra nézve 1,0 mg/ml végkoncentrációban. A pH- t, 6,6 értéken tartjuk. Az elegyet egy éjszakán át 0 *C körüli hőmérsékleten tartjuk. 0,005% végkoncentrációban timerszolt adunk hozzá. A pH-t ellenőrizzük, és szükséges esetben 6,8-ra állítjuk. Noha a találmány szerinti eljárást a fentiekben részletesen ismertettük, beleértve az előnyös megoldásokat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
