201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
5 HU 201 680 A 6 alfa- és béta-IFN-től eltérően, a gamma-IFN biológiai aktivitása nagymértékben csökken savas kémhatásnak (pH 2) kitéve, és (ii) az alfa- és béta-IEN-nel szemben készített antiszérumok nem adnak keresztreakciót a gamma-IFN-nel. Fentieken kívül a viszonylag nyers gamma-IFN készítményekkel végzett kísérletekből arra következtethetünk, hogy számos biológiai különbség is van. Például Dianzani F. és munkatársai kimutatták, hogy a gamma-IFN sokkal lassabban indukálja a vírusellenes állapotot, mint a béta- vagy alfa-IFN [Nature 283,400 (1980)]. Ezzel szemben a gamma-IFN sejtnövekedést gátló és tumorellenes szerként lehet, hogy hatásosabb [Crane J. L. Jr. és munkatársai: J. Nat. Cancer Inst. 61, 871 (1973); Gupta és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76,4817 (1979); Blalock és munkatársai: Cellular Immunology 49,390 (1980)]. Az IFN rákgyógyászati célú klinikai vizsgálatát gátolta az a tény, hogy nem tudták elegendő mennyiségben előállítani. A génsebészeti eljárások ezt a problémát megoldották, és a National Cancer Institute-ban már folynak a kísérletek a humán interferon (hIFN) nagy léptékű előállítására. így mind a természetes, mind a rekombináns hIFN-ek ismertek, és klinikai használatban vannak. A találmány szerinti eljárásban használt humán TNF (hTNF) előállítására és tisztítására kidolgoztunk egy eljárást (lásd 197 358 lajstromszámú magyar szabadalmi leírást). Az eljárás a klinikai vizsgálatokban igen hasznos lehet Több, mint 30 humán sejtvonalat vizsgáltunk szövettenyészetben, TNF-termelő képességük szempontjából. Megállapítottuk, hogy a fórból-12-mirisztát- 12-acetát (PMA) jelenléte szükséges a hTNF termelés fokozásához. A PMA mint tumort elősegítő szer ismert. Jelenlegi ismereteink szerint a B-sejtvonalak, PMA-val vagy anélkül a legígéretesebb források a hTNF előállítására. A hTNF-et a fentebb ismertetett standard TNF-vizsgálati módszerekkel - azaz a tumorölő hatást az in vivo, az L-sejtekkel szembeni citosztatikus/citotoxikus hatást in vitro módszerrel - vizsgáltuk. A T-sejtek, monociták, és promyelocita sejtvonalak csak kevés TNF-et termelnek, vagy egyáltalán nem termelnek TNF-et. Eljárásunk szerint sem külső eredetű BCG, sem külső eredetű endotoxin nem szükséges a hTNF előállítására. Meglepő módon szinergetikus tumorellenes hatást tapasztaltunk, ha a hTNF-et rekombináns vagy természetes eredetű hIFN-nel együtt alkalmaztuk humán tumorsejtek elpusztítására vagy gátlására. A hIFN vagy hTNF önmagában alkalmazva is tumorellenes hatást mutat, de a hTNF hatása hIFN-nel együtt alkalmazva nagyobb, mint a fenti hatóanyagok külön-külön mért tumorellenes hatásának összege. A találmány értelmében hTNF forrásként humán sejtvonalakat használhatunk. Az egér TNF előállítási eljárása nagymértékben függ a BCG és az endotoxin hatásától. A találmány szerinti eljárásban a humán TNF-et humán B-sejtek termelik, BCG vagy endotoxin hozzáadása nélkül. így az előállított TNF lényegében endotoxintól, valamint bakteriális és szérum szennyeződésektől mentes. Mint az 1. táblázatban látható, a vizsgált vérképző sejtek közül a B-sejtek a legjobb TNF-termelők. Az exogén BCG vagy exogén endotoxin nélküli nagymértékű TNF-termelés igen meglepő. Kis mennyiségű, vagy nyomnyi hTNF a T-sejtek, monociták vagy pro-myelociták sejttenyészetének felülúszójában is található. In vitro L-sejt vizsgálattal [Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke] meghatározták a humán eredetű sejtek által termelt TNF mennyiségét. Azonban először sikerült az általunk kidolgozott eljárással magas TNF-szintet úgy előállítani, hogy a TNF minden exogén endotoxin szennyeződéstől mentes, mivel a tenyészethez - mint azt később ismertetjük - egyáltalán nem adunk endotoxint. Mások korábbi kísérleteikben egér TNF esetén az endotoxin jelenlétét zavarónak találták, mivel a rendszert nehéz az endotoxintól mentesíteni. Az EBV-transzformált B-sejtvonalak melanómás betegektől származnak [Houghton és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77,4260 (1980)]. A többi sejtvonalat a Sloan-Kettering Institute-tól, dr. Lloyd Old, dr. Jorgen E. Fogh és dr. Peter Ralph sejtbank-gyűjteményéből kaptuk. A LuklI sejteket dr. W. Stewart [Pickering és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77,5938 (1980)] bocsátotta rendelkezésünkre. A vérképző humán sejtek TNF-termelésének vizsgálatára milliliterenként 5 x 10? sejtet tenyésztünk 8% magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó RPMI 1640 táptalajban, 10 ng/ml PMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) jelenlétében, vagy anélkül. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A 2. táblázatban ismertetjük az RPMI 1640 táptalaj összetételét. A sejteket 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd centrifugálással összegyűjtjük, és PMA nélküli RPMI 1640 táptalajban újraszuszpendáljuk, 1 x 10 6 sejt/ml koncentrációban. 48 óra múlva a sejttenyészeteket lecentrifugáljuk, A sejtmentes felülúszókat -20 °C-ra hűtjük. A TNF-aktivitást a fenti felülúszókban határozzuk meg, feles hígítás után, L-sejtes vizsgálati módszerrel. Az in vitro vizsgálatban használt NCTC 929 klón (L)-sejtvonalból származó egér L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól szereztük be, és Eagleféle minimál táptalajon (MEM) (GIBCO, Grand Island, N. Y., USA) tenyésztettük, amelyet nem-esszenciális aminosavakkal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 g/ml streptomicinnel és 8% hővel inaktivált magzati borjúszérummal egészítettünk ki. A tenyésztést 37 ‘C-on végeztük. Az egér TNF-rezisztens L-sejtvonalat [L(R)] szenzitív L-sejtekből [L(S)] tenyésztettük ki, egér TNF- et tartalmazó táptalajba történő többszöri átoltással. A hTNF-aktivitás vizsgálatot úgy végezzük, hogy a vizsgáló lemez (24 lyukú Costar lemez) lyukaiba 0,5 ml táptalajban 50 000 tripszinezett L-sejtet mérünk, majd 3 óra múlva hozzámérünk azonos térfogatban (0,5 ml) olyan táptalajt, amely a TNF-et sorozathígításos koncentrációban tartalmazza, és meghatározzuk 48 óra elteltével fázis-mikroszkópos vagy tripán-kék kizárásos módszerrel azt a protein-mennyiséget, amely 50%-os sejtpusztulást okoz. Mint az 1. táblázat adataiból látható, a humán B-sejtek által termelt hTNF az egér L(S) sejtekre citotoxikus hatást fejt ki, míg az egér L(R) sejtekkel szemben nem citotoxikus a fentebb ismertetett standard egér TNF vizsgálatban. A hTNF szempontjából vizsgált sejteket vagy tumor növekedést serkentő szer jelenlétében, vagy anélkül tenyészthetjük. A PMA például a B-sejtek hTNF-termelését többszörösére növeli, az 1. táblázat L(S) oszlopában található adatok szerint (lásd PMA nélkül/PMA jelenlétében oszlop). A PMA TPA néven is ismert. Az L(929) (ATCC) sejtvonalból származó, hTNF-el szemben rezisztenssé tett tenyésztett egér L-M sejtek -5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
