201674. lajstromszámú szabadalom • Eljárás autoimmun jellegű leukoencephalomyelitises kórképek, például a sclerosis multiplex gyógyítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására
3 HU 201 674 B 4 tisztított tengerimalac mielin bázikus fehérjét és 100 pg elölt Mycobacterium Tuberculosis-t, 50 fxl steril, 7- 7,2 pH-ju 0,14 molos foszfát oldattal pufferolt fiziológiás só oldatban oldunk és az oldatot 50 pl komplett Freund adjuvánssal emulgeáljuk. Az így kapott emulziót standard állatházi körülmények között tartott körülbelül 300 g súlyú, mindkét nemű beltenyésztett R9 és R9 albino tengerimalacok bal hátsó talpába oltjuk a 0. napon. Az immunizálás hatására az állatok az immunizálást követő 12. napra betegszenek meg, a 14. napra a kontroll állatok csoportjában az elhullás 90%-os. A kezelést az oltással egyidőbcn a 0. napon kezdjük meg. A kezelés abból áll, hogy 5 állatból álló csoportoknak naponta egyszer vagy kétszer egyenlő dózisban 20%-os aszkorbinsavban oldott (+)-apovinkaminsav-etilésztert adunk 0,25,2,5 és 12,5 mg/kg-os napi dózisban intraperitoneális adagolásban és figyeljük a túlélést, mely az alkalmazott gyógyszeres kezelés legkomplexebb olyan mérőszáma, ami a terápia hatékonyságát, valamint egyéb káros mellékhatásait is magában foglalja. A túlélési átlagértéket úgy számítjuk ki, hogy a kezelt állatcsoport egyedeinek túléléseiből számtani közepet számítunk. A kísérlet időtartama 21 nap, ugyanis az irodalomban a 20 napos túlélést már az akut gyulladás túléléseként értelmezik. Az eredményeket az I. táblázatban tüntetjük fel. I. táblázat Az akut kísérletes allergiás leukoencephalomyelitisben szenvedő tengerimalacok túlélése napokban (a kísérleti időtartam: 21 nap) Kezelés Anyag Dózis (mg/kg/nap) (i.p.) Túlélés ideje (nap) Kontroll (fiziológiás só) 12,0 (+)-Apóvinkaminsav-0,25 17,4-etilészter 2,50 20,4 12,50 20,0 A táblázatból látható, hogy az alkalmazott (+)-apovinkaminsav-etilészter dózis gyakorlatilag kivédte az állatok akut kísérletes leukoencephalomyelitis-ének halálos kimenetelét A vizsgálat befejeztével a kísérletben elhullott, illetve a 21. napon még túlélő, éterrel túlaltatott állatok agyát és gerincvelejét kipreparáltuk és 10%-os formalinben fixáltuk. A mintákból 4, az idegrendszer különböző részeiről származó kimetszésen formol-paraffinos metszeteket készítettünk és haematoxilin-eozin, rostos glia, valamint szelektív mikroglia [Gallyas F.: Acta Neuropath. 16,35-38. és 39-43. (1870)] festéseket végeztünk. Az állatok kipreparált központi idegrendszerének négy régiójából (frontálisan korongok agyszelet, agytörzs-kisagy, gerincvelő felső és alsó szegmentuma) végeztünk szövettani vizsgálatot. A kontroll állatokban az agyban (la ábra), az agytörzsben (lb ábra) és a gerincvelőben gyulladásos és gliasejtes szaporulat jött létre az idegsejtek károsodásával és kiterjedt szövetpusztulással (le ábra). Az (+)-apovinkaminsav-etilészterrel kezelt állatokban a gyulladás lényegében perivascularis localisatiójúvá redukálódott az erek falát megvastagítva (3. ábra). A szürke- és fehérállományban idegsejtpusztulás, ill. szövetpusztulás nem vagy csak igen kis mértékben jött létre, amit az utóbbi ábrán, a perivascularis terület kivételével, a gyulladásos és gliasejtek kontrolihoz viszonyított csekély száma is mutat. A fentiek alapján megállapítható, hogy az alkalmazott (+)-apoyinkaminsav-etilészter nagymértékben növeli az akut kísérletes allergiás leukoencephalomyelitises állatok túlélését, csökkenti a klinikai és egyidejűleg az ennek hátterében álló histológiai eltéréseket. Azokban az állatokban, melyekben a kezelés hatásos volt, a központi idegrendszeri gyulladás a szürke- és fehérállomány t jórészt megkímélte és perivascularis localisatiójú formában nyilvánult meg. Összehasonlítható farmakológiai vizsgálatokat is végeztünk egy, az autoimmun eredetű leukoencephalomyelitis következtében előálló demyelirtizációs kórképek, például a sclerosis multiplex terápiában használatos szteroid típusú gyulladásgálló szerrel, a Dexamethason-nal. A vizsgálatot az előzőekben ismertetett módon hajtottuk végre, azzal a különbséggel, hogy ún. outbred tengerimalacokon végezve a kezelést már az immunizálás előtt egy nappal megkezdtük, és a napi dózisokat két részletben, időben lehetőleg egymástól távol, például reggel és délután, adtuk be. Kontrollként egyrészt a Dexamethason oldószerét, a fizológiás konyhasó oldatot, másrészt a (+)-apovinkaminsav-etilészter oldásához használt oldószert, azaz 0,75%-os borkősav-oldatot alkalmazunk. A kezelést a (+)-apovinkaminsav-etilésztcr 0,75%-os borkősavas oldatával végezzük és referenciaként a Dexamethason fiziológiás sőoldattal készített oldatát használjuk. A kezelés eredményeit az alábbi II. táblázat tartalmazza. A táblázatban feltüntettük a kezelésre alkalmazott anyagokat, s kezelt állatok számát, a neurológiai tünetek megjelenésének időpontját, amelyen azt az időpontot értjük, amikor az immunizálás után az adott állaton az első neurológiai tünetek - amely általában az ataxia (imbolygó járás) volt - megjelentek. Ezeket az értékeket az azonos kezelést kapott állatoknál átlagoltuk és az átlagot írtuk a táblázatba. Az elhullás rovatban azt tüntettük fel, hogy az állatok átlagosan hány nappal pusztultak el az immunizálás után. Abban az esetben, hja ez a szám 21, ez azt jelenti, hogy a 21 napig tartó vizsgálat során nem történt elhullás. A túlélés rovatban azt tüntettük fel, hogy a kezelt állatok hány százaléka érte meg a vizsgálat végét, azaz a 21. napot. A (+)-apovinkaminsav-etilészterrel kezelt állatoknál kapott eredményeket a 0,75%-os borkősav oldat kontrolihoz, mint a Cavinton oldószeréhez, hasonlítottuk, míg a Dexamethason-nal kezelt állatok adatait a fiziológiás konyhasó oldatot kapott kontroll állatok adataihoz, mivel a Dexamethason-t ebben oldottuk. A 0,75%-os borkősavat és a fiziológiás konyhasó oldatot kapott állatoknál a tünetek megjelenése és az elhullás időpontja nem tért el szignifikánsan a két kontroll csoportnál, tehát gyakorlatilag azonos volt a betegség lefolyása. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
