201658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával
1 HU 201 658 B 2 A találmány kártevő rovarokra, különösen Dipterákra (szúnyogok, legyek) szelektíven letális hatású baktérium endotoxin-tartalmú hatóanyag előállítására vonatkozik Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával. A hatóanyagot toxikus metabolit stabil termelésére szelektált Bacillus thuringiensis var. israelensis törzzsel állítjuk elő fermentációs úton. Az eljárás szerint előállított tennék szelektív hatású mikrobiológiai rovarirtó készítmény hatóanyaga, amely alkalmas a rovarok megsemmisítésére, illetve élőhelyeiken egyedszámuk olyan szabályozására, amit humán-komfort és egészségügyi kívánalmak szükségessé tesznek. A kapott termék lé, sűrítmény vagy porrá alakított készítmény formájában közvetlenül felhasználható, adott esetben más stabilizáló, adjuváló-formáló szerekkel keverhető a felhasználási cél és alkalmazás technológia kívánalmai szerint. Ismeretes, hogy az elterjedten alkalmazott kémiai rovarirtószerck nemcsak a célrovart pusztítják el, hanem a biocönózis hasznos tagjait is. Az alkalmazás technika korszerűsödése sem csökkenti az ilyen irányú veszélyeztetését az élővilágnak, sőt gyakran kifejezetten fokozza azt, pl. a levegőből végzeu permetezések (Sáringer Gy. et al: 1984 A balatoni szúnyogirtás tapasztalatai. Természet Világa, 115. évf. 7.294-297). A kemikáliák idővel rezisztens típusokat szelektálnak, az újabb hatásos készítmények előállítása jelentős szellemi és gazdasági potenciált köt le. Ismeretesek azok a törekvések, amelyek a biocönózis ártalmatlan vagy hasznos tagjait kímélő védekezési technológiák kidolgozását és bevezetését tervezik. Ezen eljárások a következő ismérvekkel jellemezhetők (Darvas, B. et al: 1979. Biológiai védekezés támadokumentáció, MÉM NAK., 53. pp.):- Kombinált (agrotechnikai, fizikai, kémiai, biológiai) védekezési műveleteket alkalmaznak,- a peszticid terhelést mennyiségében és minőségében csökkentik (PMS, pest management system),- a kártevék leküzdésében a természetes flóra és fauna elemeket is használják (integrált növényvédelmi technológiák). Humán toxikológiai szempontok is indokolják a környezet peszticid terhelésének csökkentését a „vegyszer nélküli” védekezési módszerek elterjesztését (Sáringer Gy.: 1985. A kémiai növényvédelem altemau'vája. Természet Világa, 116. évf. 9.410-412.). A B. thuringiensis tenyészetek entomopatogén hatását 1901-ben Ishiwata fedezte fel. (Ishiwata, S.: 1901. On kind of severe flacheric (sotto disease), I. Dainikion Sanshi Keiho, 9:1-5). A baktérium toxin hatásspektrumát Hempel-Angus (1956-59) vizsgálta részletesen (ciL: Yamvries C.: 1962. A Bacillus thuringiensis Berliner hatása lisztmolyhemyókra. Entomophaga, Tom. VII. No. 2., 2. n.é., 101-159). A biológiai értékmérés módszereit a larvicid hatással kapcsolatban Yamvries idézett munkája ismerteti részletesen. Bár 1961-ben több országban forgalmaztak B. thuringiensis hatóanyagot tartalmazókészítményeket, a kezdeti gyakorlati felhasználás nem mindig volt eredményes. így például az Anagasta lárvák ellen kipróbált SPOREIN 1,7%-os koncentrációban sem biztosította a kívánt hatást (Krieg, 1961., cíl: Yamvries, 1962.) A kétszárnyúak (Diptera) különösen a szúnyogfélék esetében Godbcrg és Margalit (1977.) tapasztalta a B. thuringiensis „spórák” meglepően gyors larvicid hatását (Goldberg,L. J. and Margalit, J.: 1977. Abacterial spore demonstrating rapid larvacidal activity against Anopheles sergentii, Uranoiaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipoens. Mosq, News 37, 355.). Az entomotoxikus B. thuringiensis metabolitok szintézisének biológiájával, biokémiájával és applikációjával Bulla et at. (1980) és Burges et al. (1981) monográfiái foglalkoznak részletesen [Bulla et al.: 1980. Ultrastructure, Physiology, and Biochemistry of Bacillus thuringiensis. Critical Reviews in Microbiology. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA. 147-204. Burges, H.D. (ed.): Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980. Acad, Press. Inc. (London), Ltd. London 1981.]. Az entomocid metabolitot termelő bacillusok elterjedtek a természetben. A toxin termelő törzseket clpuszult rovarokból lehet izolálni. (Russel et at.: 1987. Selective process for Efficient Isolation of Soil Bacillus sp. Appl. and Envir. Microbiol. Jay. 1263-1266.) A spórák talajból is életre kelthetők (Petras, S. F. and Carida, L. E. Jr.: 1985. Survival of Bacillus thuringiensis Spores in Soil. Appl. and Environ, Microbiology, Dec. 1985. p. 1496-1501.). AB. thuringiensisnek 17 szubspeciese ismert. A H14 B. thuringiensis var. israelensis (HD-567) ismert dipterákra ható endotoxin termelésről. Az egyes szerotípusok enzimaktivitás spektrumban különbözhetnek egymástól, utóbbinak fermentációs ipari jelentősége lehet. Az entomotoxikus zárványok („kristályok”) fehérjetermészetűek. Szerotípustól függetlenül 18 aminosavat tartalmaznak. Kivételt képez egyesek szerint a var. israclcnsis, amelyikben CM-cysteint nem tudtak kimutatni (Davidson,E. W., and Yamamoto,T.: 1984. Isolation and Asay of the Toxic Componenet from the Crystals of Bacillus thuringiensis var. israelensis. Current Microbiology, Vol. 11, pp. 171-174.). Dana, J. et al. (1981) ezzel szemben a var. israelcnsisnél is talált a kristályokban cystein savat. (Dana, J. et al.: Comparative Biochemistry of Entomocidal Parasporal Crystals of Selected Bacillus thuringiensis Strains. J. of Bactcrio! Feb. 1052-1062.) Főleg aszparaginsav, glutaminsav, valin, leucin, alanin fordul elő. A kristály-fehérjék izoclektromos pontja alacsony. A var. israelensis kivételével a cisztin tartalom alapján diszulfid kötések jelenléte valószínű. A fehérje krisiályok oldódnak 0,1 N NaOH-ban, 8 M guanidin-kloridban, 8 M karbamidban, lúgos tioglikolálban. A fehérje kristályok afermentációs degradációja után nagy molekulatömegű (>800 000 dalton) és kis molcku latömegű (>10 000 dalton) frakciók képződnek. Yamamoto et al. (1983) szerint a B. thuringiensis var israelensis esetében a 28-kDal protein frakció felelős a toxikus hatásért. (Yamamoto, X, Izuka, T. and Aronson, J. N.: 1983. Mosquitocidal Protein of B. thuringiensis subsp. israelensis: Identification and Partial Isolation of the Protein. Current Microbiology, Vol. 9. pp. 279- 284.). A Davidson és Yamamoto (1984) által elvégzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a 28-kDal toxikus proteinből izolált 25-kDal fragmentum felelős az inszekticid, citolitikus, hcmoütikus és egér-toxikus hatásért. Inscll, J. P. és Fitz-James, P. C. (1985) elektromikroszkópos technikával kiegészítve végezte el az entomotoxikus sejtzárvány vizsgálatát. Megállapították, hogy a multi5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
