201658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával
3 HU 201 658 B 4 szegmentált ovoid zárvány a B. thuringiensis var. israelcnsisben két struktúrában és összetételben eltérő komponensből áll. Az úgynevezett „sötét” szegmentum (70 000 Dalton) nem toxikus. A toxint a „világos szegmentum” képviseli (26 500-27 000 Dalton polipeptid). Véleményük szerint a sötét szegmentum prekurzora a toxikus „világos” polipeptidek. (Insell, J. P. and Fitz-James, P. C.: 1985. Composition and Toxicity of the Inclusion of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Applied and Enviromental Microbiology, July. p. 56-62.) Luthy, P. és Studer, D. (1986) szerint a B. thuringiensis var. israelensis „parasporális zárványa” szabálytalan alakú test, amit burok vesz körül. Elektron-denzitás szerint három fragmentumot különítenek el a képződményen, amelyeket szintén burok vesz körül. (Lüthy, P. and. Studer, D.: 1986. Control of Simuliid blackflies and mosquitoes with Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. MIRCEN Journal, 2,91-99.). A delta endotoxinok termostabilak, magasabb rendűekre veszélytelenek. A B. thuringiensis var. israelensis parasporális zárványai viszonylag szűk spektrumban rendelkeznek entomotoxikus hatással (Lüthy és Studer, 1986.). A hatás lényegében a Nematocera alrendre (Diptera rendre) korlátozódik. A parasporális zárványok ICL1 p/ml koncentrációban toxikusak az Aedcs aegypti lárváira (sárgaláz), a Culcx pipicns subsp. quinaquefasiatusra (encefalitisz), valamint az Anopheles albimanus lárváira is (malária). Meglepően hatásosnak találták Simulium damnosum chlorphoxim rczisztens típusai ellen („blackfly”), amelyek az onchocerciasis („river blindness”) vektorai. (Lüthy és Studer 1986). Adella-endotoxin hatása a következőkben foglalható össze: a toxinkristály a lúgos kémhatású előbél szakaszban feloldódik. A toxin bénítja a perisztaltikát, a lárvák beszüntetik a táplálékfelvételt. Az epithel sejtek károsodnak, a bélbolyhok lepusztulnak. A foszfolipáz oldja a kitinmembránt, a spórákból kicsírázó vegetatív sejtek betörnek a testfolyadékba, szepszist okoznak. A toxinmolekula receptorai valószínűleg bizonyos lipidek a sejtmembránban. AB. thuringiensis készítmények a fentebb ismertetettek miatt főleg az intenzíven táplálkozó lárva alakok ellen hatásosak. Az életképes spórák a larvicid hatást jelentősen támogatják. A B. thuringiensis eredetű entomocid készítmények az alábbi különös előányt jelentő tulajdonságokkal rendelkeznek:- emlősökön a rovarok ellen használatos dózisban akut toxieitást nem okoznak,- kumulációs hatás nem észlelhető,- mutagén és teratogén hatás nem észlelhető,- madarakra, halakra a rovarok ellen alkalmazott koncentrációkban veszélytelenek,- a beporzó rovarokat kímélik,- a hasznos eklo- és endoparazitákat kímélik. Ismeretes, hogy a B. thuringiensis törzsek a laboratóriumi fenntartás során spontán mutációval jelentős változékonyságot produkálhatnak: S-R teleptípus változás, szénforrás hasznosító képesség megváltozása, pigment termelés megjelenése, asporogén változat kialakulása, változás a szaporodás dinamikában, változás a sejtfal összetételben. Ipari szempontból fontos az a tapasztalat, hogy a szubkultúrák a laboratóriumi fenntartás során elveszthetik toxin és spóraképző tulajdonságukat, ezzel az entomotoxieitást. Az S fonnák virulensebbek az R formáknál. (Smirnov, V. V., Reznyik, Sz. R., Vasziljevszkaja, I. A.: 1986. Aerob spóraképző baktériumok. Medicina Könyvkiadó, Budapest. 46-47.). A virulencia és patogenitás elvesztése is előfordul, ami meghiúsítja a védekező anyag (MCA) gyakorlati bevezetését (Müller-Kogler, E.: 1965. Pilzkrankheiten bei Insecten, Paul Parey, Berlin). A Bacillus thuringiensis var. israelensisnél Yamamoto és társai (1983) számoltak be EMS indukált mutánsokról, amelyek igen jelentős eltéréseket hordoztak a szülővonalhoz viszonyítva. Az Í1069-3 mutáns legalább két eltérő toxinkristály méretet termelt Az úgynevezett i 1042-8 mutáns csak apró kristályokat képzett, az Ü069-9 mutáns egyáltalán nem termelt kristályt. Az egyes mutánstípusok biológiai vizsgálata azt mutatta, hogy a szülővonal és a két különböző méretű kristálytermelő mutáns jelentős moszkitocid aktivitással rendelkezett. Az apró kristályokat termelő és a kristályt nem termelő mutáns nem rendelkezett moszkitocid hatással. A toxin fehérje frakciók vizsgálatát elvégezve azt tapasztalták, hogy a B. thuringiensis var. israelensis esetében az entomotoxieitás a 28-kDal protein jelenlétéhez kapcsolódik. (Yamamoto, T., Iizuka, T., and Aronson, J. N.: 1983. Mosquitocidal Protein of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis: Identification and Partial Isolation of the Protein. Current Microbiology, Vol. 9. 279-284.). Fermin, G. et al. (1988) olyan B. thuringiensis var. israelensis spontán mutánsról számolnak be, amely az eredeti vad típushoz képest endotoxin kristályt termelő képességét elvesztette. (Fermin, G. et al.: 1988. Structural Relatednes between Mosquitocidal Endotoxins of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl. and Envir. Microbiology, Jan. p. 277-279.). A B. thuringiensis tenyészetekkel biomassza előállítására számos eljárás ismert A 3 076 922 USA szabadalom (Mechals, 1963) SSF (Semi solid fermentation) eljárást ismertet. Az eljárásban hordozónak búzakorpaperlit keveréket használnak, amit áramló gőzzel 60 percig sterileznek oltás előtt. A sóalap NaCl-t és CaCl2-t tartalmaz. Nitrogén forrásnak szójalisztet, szénfonásnak glükózt használnak. Különös hátránya az eljárásnak a nehézkes és költséges stcrilezés. A nedvesített búzakorpa még perlit mellett is hajlamos összeállni, ezzel drasztikusan csökkenteni a levegőztetés hatásfokát. Az átáramoltatott levegő kiszárítja az SSF-ágyat, a nedvesített és száraz levegővel kombináltan történő víztartalom szabályozás a rendszerben viszont bonyolult, költséges és gyenge hatásfokú. Dulmage és Rhodes (1971) megkísérelték a fenti eljárást gazdaságosabbá tenni, úgy hogy „tiszta” de nem steril levegőt vezettek az SSF-ágyba. A levegő a csomósodó búzakorpa ágyban azonban csatornákat alakított ki, a levegőztetés hatásfoka csökkent, a tenyészet gyakran elfertőződött. (Dulmage, H. T. and Rhodes, R. a.: 1971. In: Microbial control of Insects and Mites ed. Burges and Hussey. Acad. Pres London, 507-540). Bulla és Yousten (1979) közöl adatot állítólag SSF technikával előállított entomocid készítményről („Biotrol XK”). A termelő törzs B. thuringiensis var. kurstaki HD-1. Aktivitás: 7500 IU/mg. A közlésből azonban nem derül ki, hogy az aktivitás a fermentált anyagra, vagy egy hígított készítményre vonatkozik [Bulla, L. A. and 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
