201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
11 HU 201608 B 12 b) A konjugátum gélszűrése Annak érdekében, hogy a konjugátumot megtisztítsuk a fölösleges nem-reagélt anyagtól vagy a kiamolekulatömegű melléktermékektől, az előbbiek szerint előállított dializált keveréket átvezetjük egy hűtött Sephacryl S-200 oszlopon (ellenőrzött pórusnagyság, kovalensen kötött keresztkötéses alkildextrón és N,N’-metilón-bisz-akrilaraid, Pharmacia Fine Chemicals, 0,8 cm x 100 cm), amelyet pH 10,4 PBS-sel hozunk érintkezésbe és eluálunk (az áramlási sebesség 10 ml/óra). Az eluálást spektrofotometriásán követjük és regisztráljuk a 280 nm-en mutatkozó áteresztési. A csúcsnak megfelelő frakciókat, amelyeket az oszlop üres térfogatának megfelelő mennyiségű eluálószerrel eluálunk, öBszeőntjük (az ÖSBztérfogat 15 ml), 1 M HCl-lel semlegesítjük és pH 7,3 PBS-sel négyszeresre hígítjuk. Ebből az elegyből 0,5 ml-es mennyiségeket fiolákba töltünk szét, a fiolákat liofilizáljuk és -80 °C-on tároljuk. 2. példa Mikrotitráló lemezek bevonása BSA-epszilon-ACA-D-ALA-D-ALA-val. A mikrolemezek hetenkénti előállításához egy tőrzsoldatot készítünk elő oly módon, hogy egy, BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t (amelyet az előző példa szerint állítottunk elő (tartalmazó liofilizált ampulla anyagát 0,5 ml pH 7,3 PBS-ben oldjuk. Ez az oldat heteken át tárolható aktivitásvesztés nélkül, ezért alkalmas törzsoldatként a hetenkénti előállítási műveletekhez való felhasználósra. A mikrolemezek üregeit (Falcon Microtest III. flexibilis vizsgálati lemez; Becton Dickonson and Co., Oxnard, Kalifornia) megtöltjük 100-100 uliter/üreg mennyiségű 1:200 higitású ilyen törzsoldattal. Egy függőleges lyuk-sort (célszerűen az utolsót) azonban üresen hagyunk, a kísérlet vakértékének meghatározásához. Ezeket a vak-mélyedéseket 100-100 uliter pH 7,3 PBS-sel töltjük meg. A mikrolemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk egy fedett dobozban, majd ötször mossuk, desztillált vízzel való megtöltéssel és kiürítéssel. 200 /uliter/lyuk mennyiségű 3%-os, pH 7,3 PBS-sel elkészített oldatot adagolunk és 2 órán át, szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni az adszorpciót, a be nem vont műanyag-felület blokkolására. A lemezeket ismét mossuk, desztillált vízzel, rázással megszáritjuk és felhasználásig 4 °C-on tároljuk. 3. példa Az anti-teikoplanin antiszérum előállítása Teikoplanin-albumin konjugátumot (TBSA) használunk fel nyulak immunizálására, az anti-teikoplanin antitestek képződésének előidézésére. A T-BSA-t úgy állítjuk elő, hogy 200 mg teikoplanint 50 mg BSA-hoz kapcsolunk, kapcsoló reagensként 300 mg l-etil-3-(3-metil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid alkalmazásával 5 ml vízben, pH 5,5-n, Goodfriend et al. [Science 144, 1344 (1964)] módszere szerint. A T-BSA-t egy éjjelen át dializáljuk, liofilizáljuk, majd 1 mg/ml koncentrációig 50 térf.% Freund-f. adjuvánst tartalmazó fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk. Ebből az oldatból 1,2 ml-rel 5 egészséges nőstény New Zealand nyulat s.c. injektálunk. 3 hónapon át 3 hetenként ugyanebből az antigén oldatból 0,5 ml-t viszünk be, emlékeztető oltásként. Ezen idő alatt az állatokból hetenként vérmintát veszünk és Elisa-módszerrel meghatározzuk az anti-teikoplanin-titereket. E módszer szerint teikoplaninnal bevont mikrolemezeket használunk és torma-peroxidázzal jelzett nyúl-IgG elleni kecske-antiszérumot alkalmazunk a kimutatáshoz. Az előbbiekben említett Elisa-módszert a kővetkezőképpen hajtjuk végre. PVC mikrotitráló lemezek (Falcon Microtest III., flexibilis vizsgálati lemez, Becton Dickinson and Co., Oxnard, Kalifornia) üregeit megtöltjük 0,1 ml/üreg mennyiségben egy olyan oldattal, amely 0,4 g/1 teikoplanint és 58 g/1 NaCl-t tartalmaz. A mikrolemezeket 3 órán át 37 °C-on fedett dobozban inkubóljuk, majd háromszor mossuk oly módon, hogy a lyukakat megtöltjük pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,15 M NaCl, 0,05 M nátrium-foszfát, majd kiöntjük ezt az oldatot. 0,2 ml/lyuk mennyiségben pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,15 M NaCl, 0,05 M nátrium-foszfát) elkészített BSA-oldatot (30 g/1) adagolunk és 2 órán ót szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni az adszorpciót, a be nem vont müanyagfelület blokkolására. A lemezeket ismét háromszor mossuk pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,15 M NaCl, 0,05 M nátrium-foszfát), majd 0,1 ml/mélyedés mennyiségben nyúl-antiszérum vizsgálati oldatot adagolunk 1:10-1:10® tízszeres skaláris hígításokban és 2 órán át 37 °C-on hagyjuk ezt az oldatot reagálni az érzékenyitett lyukakkal. pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal való alapos mosás után (az oldat összetétele: 0,15 M NaCl, 0,05 M nátrium-foszfát (0,1 ml/mélyedés mennyiségben termo-peroxidázzal jelzett nyúl-IgG-kkel szembeni kecßke-antiszérumot adagolunk és 1 órán át 37 °C-on hagyjuk végbemenni a reakciót. pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M NaCl, 0,01 térf./térf.% Tween 20) a mikrolemezeket alaposan mossuk, majd 'rá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
