201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
13 HU 201608 B 14 zással megszáritjuk és mindegyik lyukba 0,2 ml peroxidéz szubsztrét kromogén oldatot (1 mg/ml o-fenilén-diamin, 5 mM hidrogén -peroxid pH 5 0,1 M nétrium-citrét puff erben) adagolunk. 30 percen ét szobahőmérsékleten hagyjuk kifejlődni a szint, és a reakciót 0,05 ml/lyuk mennyiségű 4,5 M kénsav hozzáadásával állitjuk meg. 15 perc elteltével mérjük, 492 nm-en, az adszorpciót. Az antitest-titert azzal a higítási faktorral tekintjük azonosnak, amely 0,2 optikai sűrűség egységet eredményez. Ha az antitest-titer legalább ltlO4, ez azt jelenti, hogy analitikai szempontból hatásos antitest-képződést érünk el. Az állatokat ekkor teljesen elvéreztetjük, majd kinyerjük a keresett antiszérumot és ezt felhasználásig -20 °C-on tároljuk. 4. példa Az anti-teikoplanin nyúl antiszérum tisztítása BSA-agarózon Módosított mátrixot állítunk elő oly módon, hogy 80 mg szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) CNBr-rel aktivált Sepherose-zal (Pharmacia Fine Chemicals, 10 ml duzzasztott gyanta) kapcsolunk, kapcsoló pufferként pH 8,3 0,1 M nátrium-kar bonét puffer alkalmazásával. Ezt a BSA-agaróz mátrixot használjuk fel a következőkben az anti-BSA-immunoglobulinoknak a 3. példa szerint előállított antiszérumból való eltávolítására. Szakaszos abszorpciós kromatográfiát végzünk oly módon, hogy 2 ml említett nyúl antiszérumot 2 ml ülepített BSA-agaróz mátrix-szál hozunk érintkezésbe. Ezt a keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni, majd üvegszűróre visszük fel, és háromszor mossuk 6 ml pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid), amely 3 tőmeg/térf.X BSA-t és 0,05 térf./térf.X Tween 20-at tartalmaz. A kinyert szűrlet az eredeti antiszérum tízszeres hígításának felel meg, amelyből eltávolítottuk az anti-BSA-an ti testeket. 5. példa A teikoplanint tartalmazó oldatok meghatározása Standard görbét veszünk fel skaláris teikoplanin hígításokkal a 0,001-1 Mg/ml tartományban. Az oldatok előállítására pH 7,3 foszfátpufferes sóoldatot használunk fel (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid), amely 3 tőmeg/térf.X BSA-t és 0,5 térf./térf.X Tween 20-at tartalmaz. 0,1 ml ilyen oldatot és 0,1 ml - a szérum pufferrel tízszeresre hígított - mintát külön-külön, 3 párhuzamos kísérletben beadagolunk a BSA-epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala-val bevont flexibilis lemezek üregeibe) ezeket a 2. példa szerint állítottuk elő). Az a specifikus kötődés kiértékelésére a magasabb koncentrációjú oldatot bevisszük a vak-kísérletnek megfelelő lyukakba (azaz azokba, amelyeket nem vontunk be a specifikus D-Ala-D-Ala megkötő anyaggal) íb. A mikrolemezeket ezután 2 órán ét inkubéljuk szobahőmérsékleten nedves, fedett kamrában, majd nyolcszor mossuk oly módon, hogy az üregeket foszfátpufferes sóoldattal megtöltjük pH 7,3, 0,05 M nátrium-foszfét, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20) és kiürítés után rázással megszáritjuk. Ezután a 3. és 4. példa szerint előállított, teikoplanin elleni tisztított nyúl-antiszérumot pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 3 tőmeg/térf.X BSA és 0,05 térf./térf.X Tween 20) 50-szeresre hígítunk. Ebből az oldatból 100 ulitert adagolunk a lyukakba és 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni a reakciót. A lemezeket nyolcszor Boguk pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20) és rázással megszáritjuk, az előbbiekben leírt módon. Mindegyik lyukba beadagolunk 100 fditer mennyiségben nyúl-IgG-k elleni, torma-peroxidézzal konjugált kecske-antiszérumot (foszfátpufferes sóoldattal elkészített 1-500-szoros hígításban), és a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. Ezután a lyukakat ismét mossuk pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal) 0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20) és rázással megszáritjuk, az előzőekben leírt módon. Mindegyik lyukba bemérünk 200 uliter peroxidáz szubsztrét kromogén oldatot (1 mg/ml o-feniléndiamin, 5 mM hidrogénperoxid pH 5 0,1 M nátrium-citrát pufferben) és 30 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk kifejlődni a szint. A szinfejlesztö reakciót ezután 50 müter/lyuk mennyiségű 4,5 M kénsav hozzáadásával leállítjuk és 15 perc múlva mérjük az abszorpciót 492 nm-en, Titertek Multiscan fotométerrel (Flow Lab. Inc.). A kötődési görbéket úgy kapjuk meg, hogy féllogaritmikus papíron felvesszük az abszorpció-értékeket a teikoplanin-koncentráció függvényében. A dózis-válasz görbét teikoplaninnal a 0,01 Mg/ml-1 Mg/ml tartományban vesszük fel és a minta koncentrációját a standard görbe alapján, interpolálással határozzuk meg. Az ismert mennyiségű teikoplanint tartalmazó oldatoknak az előbbi eljárás segítségével végzett ismételt vizsgálata arra mutat, hogy ez a módszer kielégíti az érzékenység, szabatosság és pontosság iránti ' analitikai követelményeket. Az előbbi eljárást megismételve és avoparcin, risztocetin, aktaplanin, A 35 512 B antibiotikum, A 41 030 antibiotikum, A 47 934 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
