201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
9 HU 201608 B 10 tározósóra, amelyre jellemzó, hogy kötődik az egy D-alanil-D-alanin dipeptid vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminélis oligopeptid által képviselt .molekuláris receptorhoz'. Különösen ilyen meghatározandó anyag valamely, a vankomicin osztályba tartozó antibiotikum, ennek egy komponense, származéka vagy aglükonja. A készlet a kővetkező elemeket foglalja magában: a) analitikai eszköz, felületén egy, az eszköz felületére ■ adszorbeálódni képes megfelelő makromolekuláris hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxi-ter-. minális oligopeptiddel; b) antitest-készitmény, amely a specifikusan meghatározandó anyaggal szembeni antitesteket tartalmazza és adott esetben c) egy fajtaspecifikus anti-antitest-készítmény, amely specifikusan az .első' antitestet (ez irányul a meghatározandó anyag ellen) szolgáltató állatfaj immunoglobulinja ellen irányul. Mint már említettük, egy kitüntetett .analitikai eszközt, amely felületén egy, az eszköz felületére adszorbeálódni képes megfelelő makromolekuláris hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidet hordoz' (bevonatos analitikai eszköz) mikrotitráló lemezek műanyag mélyedései, kémcsövek vagy műanyag-lemezek képviselik, amelyeket 0,025-1 pg, előnyösen 0,1-0,2 pg BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val vontunk be. A meghatározandó anyagra specifikus antitest mennyiségének az első antitest készítményben nagyobbnak kell lennie, mint a meghatározandó anyag mennyisége. Az ilyen antitest lehet egy monoklonális antitest vagy egy poliklonális antitest, amelyet előnyösen a vérminta vételének időpontjában 10“*-nél magasabb antitest-titerrel rendelkező immunizált nyulakkal állítunk elő. A .második' antitest-készítmény koncentrációja (ez a specie-specifikus antitest-készitmény) nyilván összefügg az .első' antitest koncentrációjával, amelyet a szilárd hordozó felületen a meghatározandó anyaghoz fogunk kötni. A második antitest ezzel ekvimoláris mennyiségben vagy célszerűen feleslegben alkalmazandó. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a .készletben' nemcsak, hogy más komponensek is lehetnek - adott esetben - jelen (pl. pufferoldatok, a kimutatáshoz használható eszközök stb.), de egyes komponensek a készlettől elkülönült formában bocsáthatók rendelkezésre, ugyanahhoz az alkalmazáshoz. A találmány oltalmi köre magában foglalja a komponenseket elkülönült alakban tartalmazó készleteket is, amelyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók. A találmány tárgya továbbá: eljárás egy . anti-teikoplanin nyúl antiszérum előállítására. Ehhez az antiszérumhoz úgy jutunk, hogy egy teikoplanin-albumin konjugátumból ismételt injekciókkal nyulakba olyan mennyiségeket viszünk be, amelyek hatásosak az anti-teikoplanin antitest képződés kiváltása szempontjából. A konjugátumot úgy állítjuk elő, hogy (1—10): 1 súlyarányban teikoplanint és szarvasmarha szérumalbumint kapcsolunk. Miután kellő idő eltelt ahhoz, hogy analitikai szempontból hatásos antitest-képződést érjünk el, az állatokat elvéreztetjük, az antiszérumot kinyerjük és adott esetben megtisztítjuk az anti-szarvasmarha-szérumalbumin iramunoglobulinektől. Ennek érdekében az anyagot azonos térfogatú mátrix-szál hozzuk érintkezésbe, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1 súlyrész szérumalbumint 100 térfogatrész aktivált, duzzasztott agarózzal kapcsolunk össze. Egy bevonatos analitikai eszköz, amely a teikoplanin és a teikoplanin-antitestek analitikai meghatározására használható fel egy PVC mikrotitráló lemezből, kémcsőből vagy egy műanyag lemezből áll, és felületére megfelelő mennyiségű teikoplanint képes adszorbeálni. A következő példák részletesebben mutatják be a találmányt. A példák nem tekinthetők korlátozó jellegűnek a találmány oltalmi köre vonatkozásában. 1. példa A BSA-epszilon-ACA-D-ALA-D-ALA előállítása a) Az epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin (epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala) konjugálása szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) Az epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t egy .kétlépcsős eljárás' segítségével konjugáljuk a BSA-val, bifunkcionális keresztkötéses reagensként glutáraldehidet alkalmazva. 250 mg BSA-t 4,5 ml pH 9,5 0,1 M Na-karbonát/hidrogénkarbonát pufferben oldunk. 0,5 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldatot adagolunk és az elegy komponenseit 1 órán át hagyjuk reagálni szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet ezután egy éjjelen ót 0,9%-os NaCl oldattal szemben dializáljuk. 125 mg epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t 0,5 ml pH 9,5 0,5 M Na-karbonát pufferben oldunk, az oldatot hozzáadjuk a diaiizéit reakcióelegyhez és az elegyet 6 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezután 0,5 ml 1 M lizin oldatot adunk hozzá és az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük, a nem reagált aktív csoportok blokkolására. A konjugátumot ezután NaCl-ra 0,15 M töménységű 0,05 M K-foszfót pufferrel (pH 7,3) szemben dializáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
