201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
7 HU 201608 B 8 írjuk le. Az analitikai eszközt, amely felületén egy, az erre a felületre adszorbeálódni képes megfelelő makromolekuláris hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxi-terminólis oligopeptidet hordoz, egy BSA-epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala-val bevont műanyag mikrotitráló lemez mélyedései képviselik. A meghatározandó anyaggal szembeni antitestek valamely, a vankomicin csoportba sorolható antibiotikummal szembeni nyúl antiszérumok, és a kimutatható markerhez kapcsolt anti-antitest-antiszérum nyúl-IgG elleni kecske-antiszérum, peroxidázzal kapcsolva. A vankomicin osztályba tartozó, előre meghatározott antibiotikummal (.előre meghatározott antibiotikum‘-mai) szembeni nyúl-antiszérumokat úgy állítjuk elő, hogy ismételten (pl. 3 hónapon át minden 3. héten) hatékony anti-.előre meghatározott antibiotikum'-antitesteket kiváltó mennyiségben egy .előre meghatározott antibiotikum'-albumin konjugátumot injektálunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy az .előre meghatározott antibiotikumot ' szarvasmarha-szérumalbuminnal kapcsoljuk össze ismert módszerek alkalmazásával. Egy tömegrész szarvasmarha-szérumalbuminra vontakoztatva pl. kb. 1-kb. 10 tömegrész .előre meghatározott antibiotikumot' alkalmazhatunk. Az állatokból hetenként vérmintát veszünk és valamely elemzési módszerrel meghatározzuk az anti-.előre meghatározott antibiotikum* antitest titereket. Alkalmazhatjuk pl. az ELISA módszert, amely ugyanazzal az .előre meghatározott antibiotikummal' bevont analitikai eszközt és egy megfelelő kimutatható mintát - pl. peroxidázzal kapcsolt, nyúl IgG-ekkel szembeni kecske-antiszérumot - használ fel. Amikor analitikailag hatásos mennyiségű antitest kézódést értünk el, az állatokat elvéreztetjük és kinyerjük az antiszérumot. Ezt adott esetben további tisztításnak vetjük alá, főként az anti-szarvasmarha-szérumalbumin immunoglobulinek eltávolítására. Ez a tisztítás abszorpciós kromatográfia alkalmazását foglalhatja magában, módosított mátrix felhasználásával. Ez pl. úgy állítható elő, hogy szarvasmarha-szérumalbumint egy - ismert módszerekkel - aktivált agaróz géllel (pl. Sepharose^zal) kapcsolunk össze. Az itt alkalmazott .analitikai eszköz' kifejezés jelentése azonos az előbbiekben megadottal. Az elemzési eljárásban való felhasználás szempontjából különösen megfelelő eszközöket képviselnek közelebbről a PVC mikrolemezek, kémcsövek vagy műanyag-lapok, amelyek felületükre analitikailag kimutatható mennyiségű .előre meghatározott antibiotikumot' képesek abszorbeálni. A találmány szerinti eljárás amellett, hogy felhasználható a meghatározandó anyag oldatokban (pl. fermentlevekben vagy kivonatokban) való specifikus, gyors és könnyű kimutatására és vizsgálatára, alkalmas biológiai folyadékok, pl. a vér és frakciói, vizek i, testváladékok, genny, hörgőből származó köpet és a bőr vizsgálatára és a meghatározandó anyag ezekben való kimutatására. A találmány szerinti eljárásnak egy biológiai folyadék elemzésére való alkalmazásához általában nem szükséges a minta különleges előkezelése, de rendszerint szükség van egy pufferrel való higitásra (ritka esetben a minta töményitésére) annak érdekében, hogy bejussunk abba a specifikus tartományba, amelyet a módszer megválasztott feltételei határoznak meg. A kalibrációs görbét előnyösen úgy vesszük fel, hogy a meghatározandó anyagot tartalmazó standard készítményt ugyanabban a biológiai folyadékban oldjuk, amely a meghatározandó mintát tartalmazza. Hörgő-eredetű köpet, izzadmány, genny és bőrminta esetében általában szükség van a mintának a meghatározás előtti homogenizálására, amely a szokásos módon végezhető el. A mintát általában pufferrel hígítjuk, rendszerint a homogenizálás előtt. A pufferhez - amely egy pH 7-7,5 vizes puffer - előnyösen az össztérfogat 10-30%-ának megfelelő mennyiségben szérumot vagy szérumfehérjét adagolunk. Ennek mennyisége előnyösen a hígító puffer össztérfogatának kb. 20%-a. A találmány egyik kitüntetett foganatositási módja szerint anti-teikoplanin-antiszérumot alkalmazunk, amely nem lép kereszt-reakcióba a vankomicinnel, avoparcinnal, risztocetinnel, A 35 512 B antibiotikummal, aktaplaninnal, A 41 030 antibiotikummal, A 47 934 antibiotikummal és a vankomicin osztályba sorolható többi antibiotikummal. A találmány szerinti eljárás kitüntetett alkalmazási tartománya a meghatározandó anyag kb. 10-100 ng/ml koncentrációja. A leginkább kitüntetett tartomány 10- -100 ng/ml. A vizsgálatközti pontosság (CV) általában 10-15%. A módszer szabatossága és pontossága tovább javítható a kísérlet megfelelő megtervezésével, amely a hibák minimális szintre való visszaszoritására irányul, az ismert statisztikai eloszlási eljárások igénybevételével. A találmány szerinti .analitikai eszköz' a kézi ill. az automatizált elemzési eljárásokban való felhasználásra egyaránt alkalmas. Ez a flexibilitás különleges fontosságú a végfelhasználó igényeinek kielégítése szempontjából. Az automatizált eljárás ténylegesen rendkívül hasznos lehet több kezelt beteg klinikai megfigyelésében - pl. a terápiás dózis ellenőrzésében és a gyógyszer eloszlásának tanulmányozásában, a biológiai folyadékokban -, mig a kézi eljárás laboratóriumi léptékű elemzések esetében adhat kielégitó eredményt. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy reagens-készlet a találmány szerinti eljárás végrehajtásához, egy olyan anyag könnyű, gyors, megbízható és pontos megha-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
