201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
5 HU 201608 B 6 Ezzel az anti-antitest-antiszérummal egy kimutatható markert kapcsolunk össze. Ez a marker az immunmeghatározásokban használatos .markerek’ egyike, pl. egy enzim, egy radioizotóp vagy egy fluoreszkáló festék. Kitüntetett enzim a peroxidáz - pl. a torma-peroxidáz -, amely kolorimetriásan kimutatható és kvantitatíve meghatározható egy kromogén szubsztrátja - pl. az o-fenilén-diamin - segítségével, hidrogénperoxid jelenlétében. A kimutatható markerrel összekapcsolt anti-antitest-antiszérumok ugyancsak a kereskedelemben hozzáférhetők vagy a szokásos eljárásokkal állíthatók elő. Mint ez a szakember számára magától értetődő, a D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptid és a megfelelő hordozó összekapcsolása ismert eljárások segítségével végezhető el. Rendszerint egy kapcsoló ágenst alkalmazunk; kitüntetett kapcsolószer a glutáraldehid. Más ismert kapcsolószerek: a karbodiimidek, diizocianátok, anhidridek, diazónium-vegyületek, azidok és a cianogén bromidok. Hasonlóképpen ismert kapcsolási eljárások és reagensek alkalmazhatók az anti-antitest-antiszérumok és a kimutatható markerek összekapcsolására. Ezeket az eljárásokat alapvetően a kiválasztott kimutatható marker tulajdonságai határozzák meg. Ha a kimutatható marker egy enzim, az előbbiekben ismertetett kapcsolási eljárások alkalmazhatók. Ebben az esetben is a glutáraldehid a kitüntetett kapcsolószer. Ezekben a kapcsolási reakciókban a reagensek aránya jelentősen változhat, bár sok esetben előnyben részesítjük a reagensek közötti kb. 1:1 arányt. Továbbá: abban az esetben, ha a kapcsolási reakciót egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptid - nevezetesen az epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala - és egy makromolekuláris hordozó - pl. szarvasmarha szérumalbumin (BSA) - között hajtjuk végre, e két reagens aránya 1:1 - 10:1 között változhat. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatositási módját a következőkben részletesebben írjuk le. a) Kalibrációs görbét veszünk fel a meghatározandó anyag ismert mennyiségei alkalmazásával, megfelelő hígító pufferben. b) Előkészítjük a mintákat és az előbbi pufferrel megfelelően hígítjuk ezeket. c) A standard hígításokat és a mintákat külön felvisszük az előzőkben bemutatott bevonatos analitikai eszközre. d) Szobahőmérsékleten, fedett nedves kamrában való inkubálás után a bevonatos analitikai eszközt mossuk és felviszünk rá egy, az .első’ antitestet tartalmazó készítményt (anti-meghatározandó anyag-antitest), amelyet az előbbi pufferrel célszerűen hígítottunk. e) A bevonatos analitikai eszközt ismét mossuk és szárítjuk, majd hozzáadjuk a .második' antitest készítményt (anti-antitest-készítmény), amelyben a fajtaspecifikus antitest egy kimutatható markerhez kapcsolva van jelen, f) Végül meghatározzuk az említett, a bevonatos analitikai rendszerhez kapcsolt .kimutatható markert’ oly módon, hogy a standard görbe értékeivel összehasonlítva kiértékeljük a meghatározandó anyag koncentrációját a mintában. Az előzőkben említett hígító puffer egy vizes puffer, előnyösen pH 7,0-7,5 foszfátpufferes sóoldat. Ha a minta szérum, hörgőből származó köpet, genny vagy bőr, a hígító puffer előnyösen 10-30 térf.X, és különösen előnyösen kb. 20 térf.X szérumot vagy egy szérumfehérje-készitményt tartalmaz. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy alkalmazásával lehetővé válik egy, a vankoraicin osztályba sorolható antibiotikumnak a könnyű és gyors meghatározása ugyanennek az osztálynak egy másik tagja jelenlétében. Bár ténylegesen a vankomicin osztályba sorolható valamennyi antibiotikum kötődik szelektíve - bár különböző mértékben - egy D-Ala-D-Ala karboxi-terminális peptidhez, a specifikus antitesttel csak a meghatározandó antibiotikum fog reagálni. Ezért, ha olyan biológiai folyadékot vizsgálunk, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával, amely pl. két, a vankomicin csoportba sorolható antibiotikumot (pl. vankomicint és teikoplanint) tartalmaz, ez a két antibiotikum szelektíve kötődik az analitikai eszközhöz - amely felületén adszorbeáltatva egy, a megfelelő makromolekuláris hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin - dipeptidet vagy karboxi-terminális oligopeptidet tartalmaz -, míg a mintában jelenlevő más anyagok (amelyek a meghatározást általában zavarják) kimoshatók. Ezután a specifikus antitest (pl. a teikoplaninnal szembeni antitest) csak az adszorbeált D-alanil-D-alanin peptidhez kötött megfelelő antibiotikummal (pl. a teikoplaninnal) fog kötést képezni, és nem a hasonló módon kötött másik antibiotikummal (pl. a vankomicinnel). A kimutatható markerhez kapcsolt fajtaspecifikus anti-antitest-antiszérum ezért, hozzáadása után, specifikusan kötődik az anti-meghatározandó anyag (ebben az esetben az anti-teikoplanin)-antitesthez, amely viszont a specifikus antigén (ebben az esetben a teikoplanin) kötődése révén a .stacionárius fázishoz’ kapcsolódik. A .kötött' fajtaspecifikus anti-antitest-antiszérum ezt követő meghatározása (a kapcsolt .marker’ kimutatása révén) ezért csak azt a vankomicin osztályba tartozó konkrét antibiotikumot (ebben az esetben a teikoplanint) érinti - még egyéb, ugyanebbe az osztályba sorolható antibiotikumok (ebben az esetben a vankomicin) jelenlétében is -, amely a vizsgálat kiválasztott tárgyát képezi. A találmány szerinti eljárás egy kitüntetett foganatositási módját a következőkben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
