201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
3 HU 201608 B 4 A D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptid lehet egy tri-, tetra-, penta-, hexa- vagy heptapeptid, amelyben a karboxi-terminális dipeptidet a D-alanil-D-alanin alkotja. A találmány szerinti kitüntetett D-alanil-D-alanin karboxi-terminélis oligopeptid egy tripeptid, az epszilon-araino-kaproil-D-alanil-D-alanin (a következőkben: epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala). A D-alanil-D-alanint vagy a D-alanil-D-alanin karboxi-terminélis oligopeptidet megfelelő hordozóval konjugáljuk annak érdekében, hogy képessé tegyük a szilárd fázis felületén való abszorpcióra. A megfelelő hordozó ebben az esetben bármilyen fehérje vagy más nagymolekulasúlyú anyag lehet, amely képes arra, hogy kovalens kötéssel kapcsolódjon a D-alanil-D-alanin karboxi-terminélis oligopeptidhez és így olyan konjugétumot képezzen, amely képes abszorbeálódni a kiválasztott szilárd fázis felületén (az adszorpciót a fizikai kötések összehúzódása eredményének tekintve). Kitüntetett példa egy ilyen hordozóanyagra az albumin, különösen a szarvasmarha-albumin. Ugyancsak használható azonban a tojásalbumin, a humán albumin vagy a sertés-albumin is. A szilárd fázis felület, amelyre a D-alanil-D-alanin-dipeptidet vagy -karboxi-terminélis oligopeptidet hordozó vivőanyagot adszorbeáltatjuk, előnyösen egy analitikai eszköz felülete. A találmány szerinti .analitikai eszköz' bármely olyan analitikai eszközt jelent, amely folyékony reagenseket befogadni képes - vagy legalábbis kitehető ilyen hatásának -, ezért felhasználható az egy megfelelő makromolekuláris vivőanyaggal konjugált D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidet hordozó felület biztosítására. Kitüntett példák az ilyen felületekre az üveg vagy műanyag mikrotitráló lemezek, kémcsövek vagy műanyag lapok. A leginkább kitüntetett .analitikai eszközt' a polietilén vagy polistirol mikrotitráló lemezek mélyedéseinek falai képviselik. Ennek megfelelően a találmány szerinti leginkább kitüntetett .bevonatos analitikai eszköz'-nek (azaz olyan felületnek, amely az oligopeptidet hordozza) az olyan műanyag mélyedések vagy kémcsövek tekinthetők, amelyeket 0,025-1 ug (előnyösen 0,1-0,2 pg) BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val vontuk be. Mint már említettük, a .vizsgálandó oldatban' feltehetően jelenlevő meghatározandó anyag egy, a vankomicin osztályba sorolható antibiotikum, vagy általánosabban egy olyan anyag, amely egy D-alanil-D-alanin dipeptiddel vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopéptiddel kötést képes alkotni. Kitüntetett meghatározandó anyag a teikoplanin vagy ennek valamelyik komponense, származéka vagy aglükonja. .A specifikusan a meghatározandó anyag ellen irányuló antitestek' olyan antitestek, amelyek keletkezését egy állatban úgy váltjuk ki, hogy a vizsgálandó anyag egy megfelelő konjugátumát injektáljuk. Ezek az. antitestek lehetnek a szokásos antiszérumok (amelyekhez úgy jutunk, hogy egy állatot, pl. nyulat, patkányt vagy más emlőst - az ember kivételével - immunizálunk), vagy az említett anyagokkal szembeni monoklonális antitestek [ezeket lényegében C. Milstein és G. Koehler sejtfúziós technikája szerint- Nature 256, 495-497, (1975) - állíthatjuk elő]. Mivel a meghatározandó anyagok haptének (azaz önmagukban, egy - az embertől különböző-emlősbe injektálva nem képesek antitestek képződésének kiváltására, de immunogén tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek akkor fejeződnek ki, amikor ezeket az anyagokat egy megfelelő, magas molekulatömegű vivőanyaghoz, pl. egy fehérjéhez kapcsoljuk), ezeket egy alkalmas vivőanyaggal kell konjugálni, a kiválasztott gazdaállatnak az immunizálása előtt. A vivőanyag szerepét általában egy fehérje, pl. a szarvasmarha szérumalbumin tölti be. A szokásos antiszérum előállításához- amelyet azután az IgG-ok elkülönítése érdekében tisztíthatunk vagy frakcionálhatunk - megfelelő gázdaállat a nyúl. Ezzel szemben a monoklonális antitesteket a szokásos módon hibridómákkal állítjuk elő, amelyekhez úgy jutunk, hogy egy fúziós promotor jelenlétében patkánylép sejteket és homológ mielóma sejteket késztetünk fúzióra, lényegében Milstein és Koehler előbb említett eljárását követve. A találmány szerinti eljárásban való célszerű alkalmazás szempontjából követelmény, hogy a szokásos antiszérum poliklonális antitestjeinek egy jelentős hányada, illetőleg a monoklonális antitestek (amelyek a .specifikusan a meghatározandó anyag ellen irányuló antitesteket' képviselhetik) ne befolyásolják a meghatározandó anyagnak (azaz a meghatározandó antibiotikumnak) a molekuláris receptoréhoz (azaz a megfelelő felületen adszorbeáltatott D-Ala-D-Ala di- vagy oligopeptidhez) való kötődését és természetesen ne lépjenek keresztreakcióba a vankomicin osztályba tartozó, a mintában esetleg jelenlevő más antibiotikumokkal, amelyek egyidejűleg a molekuláris receptorhoz kötődnek. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott .anti-antitest antiszérumok ‘ bizonyos állatfajok immunoglobulin G-ivel (IgG) szembeni szokásos antitest-készitmények, mimellett ezek azok az állatfajták, amelyekhez az .első’ antitest (azaz a meghatározandó anyag elleni antitest) tartozik. Az ilyen antitest-készítményeket - amilyen pl. a kecske nyúllal szembeni antiszéruma, a kecske patkánnyal szembeni antitestjei - a szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő, de ezek a kereskedelemben is hozzáférhetők. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
