201578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bottromycin A2 előállítására
9 lü HU 201578 B A bottromycin A2 toxicitásénak jellemzésére meghatároztuk egérben egyszeri dózis után az akut LDso értékeket. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat A bottromycin Ai akut toxicitásénak vizsgálata egerekben Egerek: OFi (LATI, Budapest) fajtájú, 14- -18 g-os nőstény egerek Megfigyelés: 14 nap Az antibiotikum Tween 80-nal és fiziológiás sóoldattal készített szuszpenzióját vizsgáltuk egyszeri alkalmazással. Az értékelést Litchfield és Wilcoxon-féle módszerrel végeztük [(J. Pharm. Exp. Ther. 96, 99 (1949)]. Vegyület Adagolás LDso módja (mg/kg) Bettromycin A2 p.o. >400 s.c. >100 i.p. 190 (120-280) A bottromycin Az jól alkalmazható haszonállatok, főleg sertések és kérődzők takarménykiegészitöjeként. Mivel nem szívódik fel, hatását helyileg fejti ki, ezért az állatok szerveiben, izomzatában és szekrétumaiban az antibiotikum megjelenésére nem kell számítani. A bottromycin A2 a hatás csökkenése nélkül kombinálható más takarmányadalékokkal. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. I. példa A Streptomyces collinus NCAIM 001073 sz. törzs élesztőkivonatot és keményítőt tartalmazó, ferdeagaron növesztett tenyészetéről készített spóruszuszpenzióval 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml steril Dll jelű alábbi összetételű táptalajt oltunk be: szójaliszt 2,5% glükóz 2,0% kazein-hidrolizátu m 2,0% (10%-os oldat) burgonyakeményítő 2,0% kukoricalekvár (50% szárazanyag-tartalom) 0,5% kalcium-karbonát 0,5% napraforgóolaj 0,4% csapvízben. Sterilezés előtt a táptalaj pH-ját nátrium-hidroxid oldattal 7,0-7,1-re állítjuk be. A táptalajt 121 °C-on 30 percig sterilezzük. A tenyésztést síkrázó-gépen (260 fordulat/perc, 2,1 cm kitérés) végezzük, 28 °C-on. A fermentáció során keletkező antibiotikum mennyiségét mikrobiológiai módszerrel, agar-diffúziós technikával mérjük (Analitical Microbiology, I. kötet: 87. oldal, szerkezeti: F. Kavanagh, 1963. Academic Press, New York), Bacillus subtilis ATCC 6633 tesztorganizmust és 8-as pH-jú agartáptalajt, valamint bottromycin A2 standardot alkalmazva. A tenyésztés 120. órájában a fermentlé 205 pg/ml bottromycin A2-t tartalmaz. 2. példa A Streptomyces collinus NCAIM 001073 sz. törzs élesztókivonatot és keményítőt tartalmazó ferdeagaron növesztett tenyészetéről készített spóraszuszpenzióval beoltunk 2 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő sterilezett, 100-100 ml, az 1. példában megadott összetételű, Dll jelű táptalajt, majd a lombikot síkrázó-gépen (260 fordulat/perc, 2,1 cm kitérés) 28 °C-on rázatjuk 48 óráig. Ezután a két lombik tenyészetével 10 1-es üvegfermentorban lévő sterilezett 5 1 UA-2 jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: burgonyakeményitő 4,0% szójaliszt 3,0% kalcium-karbonát 0,5% glükóz 0,1% magnézium-szulfát x 7H2O 0,05% kobalt-nitrát x 7H20 0,0002% napraforgóolaj 0,3% csapvízben. A táptalaj pH-ját In nátrium-hidroxid oldattal 7,0-re állítjuk be. Ezt követően 121 °C-on 1 órán át végezzük a sterilezést. A fermentációt 28 °C-on, 300 liter/óra levegő átvezetése és 260 fordulat/perces keverés mellett folytatjuk le. Habzástól függetlenül 24 óránként 2 ml napraforgóolajat adagolunk. A fermentáció 120. órájában 255 /ug/ml antibiotikum koncentrációt mértünk a fermentlében az 1. példában leírt módon. A fermentáció befejezése után a fermentlé pH-ját keverés közben 3-as értékre állítjuk 15%-os kénsav oldattal, majd a fermentlevet megszűrjük. A szűréssel elkülönített micéliumot 800 ml vízzel mossuk, majd a mosófolyadékot a szűrlettel egyesítjük. Ezt követően a kapott oldat pH-ját 9-es értékre állítjuk 2n nátrium-hidroxid oldattal, majd az oldatot kétszer 1200 ml, illetve 800 ml etil-acetáttal extraháljuk. A nedves micéliumot kétszer 1 liter metanollal kivonatoljuk, a metanolos kivonatokat egyesítjük és a metanolt csökkentett nyomáson 45-50 °C-on besűrítjük. A vizes maradék pH-ját 2n nátrium-hidroxid oldattal 9-es értékre állitjuk, majd a kapott oldatot kétszer 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az így kapott etil-acetátos kivonatokat és a fermentlé szűrletének etil-acetátos extraktumát egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk. Ilyen módon 5,61 g olajos nyersterméket kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
