201538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-hidroxi-2-/4-metoxi-fenil/-5-/2-(metil-amino)-etil/-2,3-dihidro-5H-1,5-benzotiazepin-4-on-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 201538 B 2 Az elvégzett farmakológiai próbák a vegyületek gyógyászati hatékonyságát igazolják. Az első próba a vegyületek kalcium-antagonista hatását mutatja ki. A használt kísérleti eljárás Godfraind és Kaba eljárásának változata [Blockade or reversal of the contraction induced by calcium and andrenaline in depolarized arterial smooth muscle. Brit. J. Pharmacol. 36, 549-560 (1969)]. A kísérleteket nyúl mellkasi aorta-darabjain hajtjuk végre. Az 1,5 kg átlagsúlyú állatokat („Fauve de Bourgogne”) a nyakcsigolya diszlokációja útján megöljük és elvéreztetjük. A mellkasi aortát gyorsan kivágjuk és 95 % 02-5 % CO2 gázeleggyel átáramoltatott Krebs-bikarbonátoldatba helyezzük. Mintegy 1 cm hosszú aortadarabokat készítünk és a fenti gázeleggyel átáramoltatott 37 °C-os Krebsbikarbonát-puffert (pH 7,4) tartalmazó 20 ml-es szervkádba tesszük őket. Az aortadarabok lumenének végeire egy-egy U-alakú fémhorgot erősítünk. Az egyik horgot a kád alján rögzítjük. A másik horog - amelyet izometrikus feszülésmérő eszközzel (Grass FT03) kapcsoltunk össze - előerősítő (Grass 7P1) útján lehetővé teszi az aortadarabok összehúzódási reakciójának regisztrálását kiíró oszcillográfon (Grass 79B). E módszer előnye - összehasonlítva spirális vagy gyűrűalakú preparátumokkal -, hogy jobban megőrzi az erek szerkezeti épségét és az összehasonlítási válasznak csak a radiális komponensét, a funkcionális szempontból fontos jelenséget (artériás nyomás szabályozása) regisztrálja. A készítményekre 4 g kezdeti feszítőerőt gyakorolunk. Fenoxi-benzamint (1 pM) és propranololt (1 pM) adunk a különböző Krebs-oldatokhoz, hogy visszaszorítsuk az erek alfa- és béta- és béta-adrenerg receptorainak aktiválásával kapcsolatos összehúzódási válaszokat. A Krebs-bikarbonát-oldatban való 1 órás stabilizálódási idő után az aortákra gyakorolt terhelést 2 g-ra csökkentjük. 30 perc várakozási idő után a preparátumokat körülbelül 10 percig inkubáljuk Krebs-bikarbonát-oldatban kalcium hozzáadása nélkül, EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav) (200 pM) és propranolol (1 pM) jelenlétében. Ezt az oldatot azután depolarizáló (káliumdús és nátrium-szegény), kalciummentes és propanololt (1 pM) tartalmazó Krebsoldattal helyettesítjük. 5 perc múlva 1 mM kalciumot adunk az oldathoz és 30 perc stabilizálódási időt alkalmazunk, ami lehetővé teszi, hogy a preparátumok kontkrakciója állandó szintet érjen el. Ezután a vizsgálandó vegyületek kumulatív dózisait alkalmazzuk 30 percenként (vízszintes szakasz eléréséhez szükséges idő) az 1 mM kalciummal előidézett összehúzódás teljes megszűnéséig, vagy a vizsgálandó termék 30 pM maximális koncentrációjáig. A kísérlet végén papáverin szupramaximális koncentrációját (300 pM) alkalmazzuk, hog meghatározzuk a készítmények okozta lehető legnagyobb dekontrakciőt. A kezdeti kontrakció (1 mM CaCh után) és az értágító vegyületek különböző kumulatív koncentráció utáni kontrakció abszolút értékét (grammokban) minden preparátumnál a 300 pM papáverin végső hozzáadása után 30 perc múlva észlelt minimális kontrakció különbségéből kapjuk meg. Az 1 mM kalciummal előidézett kontrakciókra vonatkoztatott %-os kontrakciócsökkenést a vegyületek minden dózisára és minden preparátumra kiszámítjuk, és az egyedi dekontrakciók %-ait átlagoljuk (X±S.D.). A kapott átlagértékeket (súlyozva a közepes standard eltérés inverzével) szigmoid görbe alakú matematikai modell segítségével analizáljuk, és kiszámítjuk azt a mólkoncentrációt, amely a kalciummal indukált kontrakciót 50 %-kal csökkenti (CEso)A találmány szerinti vegyületek pCEso értékei 5,0-7 közé esnek. A találmány szerinti vegyietekkel olyan próbát is végzünk, amely a „PAF” (platelet activating factor) specifikus kötődése gátlását mutatja ki. A kísérleti állatok 2,5-3 kg tömegű nyulak, amelyek nátrium- pentobarbitállal [0,25 mg/kg, intravénás úton] elaltattunk és a gégébe bevezetett cső segítségével mesterségesen lélegeztettünk. A nyaki verőérből vért veszünk és citrátos véralvadásgátlót tartalmazó csövekben gyűjtjük össze. A csöveket 10 percig lOOxg- vei centrifugáljuk, a vérlemezkedús plazmát 150 mM NaCl-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 2 térfogat 10 mM Trisz-HCl pufferrel (pH 7,5) hígítjuk (A-puffer). 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk, majd az üledéket 2 térfogat A-pufferrel mossuk, és újra cetrifugáljuk. A vérlemezkékben gazdag csapadékot jéghideg pufferben (5 mM MgCl2-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM Trisz-HCl, pH 7,0) szuszpendáljuk, homogenizáljuk és 4 °C-on 10 percig centrifugáljuk. E műveletet megismételjük, a kapott üledéket a fenti pufferben szuszpendáljuk, homogenizáljuk és a membránszuszpenziót folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. A kötődés gátlásának vizsgálata céljából a szuszpenziót felolvasztjuk és pufferrel oly mértékben hígítjuk, hogy fehérjetartalma körülbelül 150 pg/ml legyen. A membránok alikvotjait (30 pg fehérje) 10 mM MgCh-ot és 0,25 térfogatszázalék borjúszérum-albumint tartalmazó 10 mM Trisz- HCl-puffer (pH 7,0) jelenlétében 2 óráig 25 °C-on 1 nM triciált PAF-fal (3H-1 -0-hexadecil-2-acetil-sn-gliceril-3-foszforil- kolin) inkubáljuk 1 ml végtérfogatban. Az inkubálás végén a membránokat összegyűjtjük és Whatmanszűrőkön gyorsan jéghideg pufferrel mossuk, vákuumszivattyúval összekötött „Skatron” sejtkollektort használva. A szűrőket megszárítjuk és radioaktivitásukat folyadékszcintillációs spektrométerben lemérjük. A specifikus kötődést a membránok 1 pM PAF jelenlétében és távollétében mért radioaktivitásának különbsége alapján határozzuk meg. A kötődés gátlását a leírt körülmények között vizsgáljuk, a vizsgálandó vegyületeket különböző koncentrációkban alkalmazva. Ezután minden vegyületnél meghatározzuk a CI50 koncentrációt (a specifikus kötődést 50 %-kal csökkentő koncentráció), a gátlási görbét a legkisebb négyzetek módszere szerint ábrázolva. E próbában a találmány szerinti vegyületek CI50- értéke 3-8 pM közé esik. Végül a találmány szerinti vegyületekkel olyan próbát is végzünk, amely a „PAF-acéter”-rel [l-O(Ci6-Ci8-alkil)-2- acetil-sn-gliceril-3-foszforil-kolin] indukált vérlemezke- agregációra gyakorolt gátló hatásuk kimutatására alkalmas. A próbát Bom (J. Physiol. 168, 178-195, 1963) módszerével hajtjuk végre, nyúl-vérlemezkéken. Szívpunkció útján vért veszünk és 3,8 %-os nátrium-cit-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
