201354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fenoxazinon-származékok előállítására mikrobiólogiai úton
3 HU 201354 B 4 más rövid szénláncú alkohollal végzett extrahálása is. A kapott színes extraktumokból a lipofil alkotókat megfelelő oldószerekkel, például kloroform és petroléter elegyével végzett extrahálás útján elválasztjuk és a kapott nyersterméket kromatográfiásan 3 frakcióra bontjuk. A zsírmentesített nyers extraktumból az egyes frakciókat célszerűen az alábbiak szerint nyerjük ki. Először a nyers extraktumot hidroxi-alkoxi-propil-dextránnal tisztítjuk, eluálószerként vizes alkanolt, például metanol és víz 9:1 tf-arányú elegy ét vagy tiszta metanolt alkalmazva. A különböző színű zónák alakjában megjelenő adszorbeált komponenseket egymás után különböző színű eluátumok alakjában izoláljuk; mindegyik ilyen eluátumban egy-egy komponens erősen feldúsult. A tiszta vegyületek kinyerése során a szokásos módszerek, így kromatográfia vagy alkalmas szerves oldószerrel végzett újabb gélszűrés kerülhet alkalmazásra. Különösen előnyösnek az LH-márkájú Sephadexen végzett kromatografálás bizonyult, aminek sorén futtatóelegyként főleg tiszta metanolt vagy metanol és viz 9:1 és 90:1 közötti tf-arányú elegyét alkalmazzuk. A fermentációs úton előállítható három vegyület amorf vagy kristályos, szilárd halmazállapotú anyagok, amelyek pH-indikétor tulajdonsággal nem rendelkeznek. Erősen poláros oldószerekben, így metanolban, dimetil-szulfoxidban és vízben jól oldódnak, alkánokban és acetonban nem oldódnak. A fermentációs úton előállított három vegyületból önmagában ismert módon az (I) általános képlet alá eső többi vegyületet is előállíthatjuk: az (1) és (2) képletű vegyületet például erős sav jelenlétében végzett metanolízissel a megfelelő észterré alakíthatjuk. A metanolízist például metanol és vízmentes sósav elegyében 1-24 órán át végezzük 20 °C és 60 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten. Az (1) jelű vegyületről az acetilcsoportot ismert módon, előnyösen vizes közegben aminoacilázzal hasítjuk le. Az (I) általános képletű vegyületek vírusok, például a Hela-sejtekben élősködő Vaccina P71 vírus, Vero-sejtekben lévő influenza A-vírus ellen, továbbá protozoák, így Trichomonas vaginalis, illetve gombák, például Candida albicans ellen hatásosak. A hatóanyagok anthelmintikumként is alkalmazhatók, mert sokfajta féreg, például Hemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Cooperia, Chabertia, Strongyloides, Oesophangostomum, Hyostrongyles, Ancylostoma, Ascaris és Heterakis ellen hatnak. Különösen jó hatásúak a gyomor-bél-rendszerben élősködő stronglidiák és tüdóférgek ellen, amelyek főleg házi- és haszonállatokat támadnak meg. Az új vegyületek ezért elsősorban az állatgyógyászatban alkalmazhatók. A hatóanyagok szilárd halmazállapotban, valamint oldva 2 és 8 közötti pH, előnyösen 5 és 8 közötti pH érték esetén stabilak, tehát a szokásos gyógyszerkészítménnyé alakíthatók. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. A százalékos adatok tőmegszázalékok, amennyiben más magyarázat nincs. A folyadékok keverési aránya térfogatra vonatkozik, ha más kikötés nincs. i. példa a) A Steptomyces spec. DSM 3813 jelű termelő törzs spóraszuszpenziójának előállítása Zabpehellyel készített ferde agar táptalajokat a DSM 3813 törzzsel beoltunk, majd 30 °C hőmérsékleten mintegy 6 napon át inkubálunk. A zabpelyhes agar a következők szerint készül: 20 g zabpelyhet 1 liter vízben 20 percen keresztül forraljuk, majd szűrjük. A szűrlethez 18 g agart, valamint 2,5 ml nyomelem-oldatot adunk (összetétele: 3 g CaCl2-2H20, 1 g Fe-III-citrát, 0,2 g MnSOí, 0,1 g ZnCl2, 0,025 g CuS04-5H20, 0,02 g Na2B40j-10H20, 0,004 g CaCh és 0,1 g Na2M604-Hz0 1 liter vízben). Sterilezés előtt a pH értékét 7,8-ra állítjuk. A ferde agárról a spórákat 3 ml folyadékkal [0,9% NaCl, 0,1% polioxietilén-szorbitán-monooleát (=Tween 80) desztillált vízben] leöblítjük. A szuszpenziókat egyesítjük és a fő tenyészet beoltásáig 4 °C-on tároljuk. b) DSM 3813 jelű termelő törzs előtenyészete Erlenmeyer lombikban 5 db 300 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba 100-100 ml tápoldatot töltünk (40 g glükóz, 30 g szójaliszt, 2,5 g NaCl, 2,5 g CaC03 1 liter desztillált vízben, sterilezés előtt pH 7,5-re), mindegyik lombikot 1,5- -1,5 ml minél frissebb spóraszuszpenzióval beoltjuk, és rázógépen 180 perc*1 rázófrekvencia mellett 30 °C-on 72 órán át inkubáljuk. c) Az (1), (2) és (3) jelű vegyület előállítása DSM 3813 jelű termelő törzs tenyésztésével 300 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba 100 ml tápoldatot töltünk (20 g szójaliszt, 20 g mannit 1 liter deszt. vízben, sterilezés előtt pH beállítás 7,5-re), 3 ml elótenyészettel beoltjuk és 30 °C hőmérsékleten 180 perc*1 frekvenciájú rázógépen inkubáljuk. A termelés maximuma 96-120 óra alatt következik be. Az (1), (2) és (3) vegyület összhozama mintegy 200 mg/liter tenyészlé. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
