201354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fenoxazinon-származékok előállítására mikrobiólogiai úton

5

HU 201354 B

6

2. példa

A DSM 3813 jelű termelő törzs tenyésztése fermentorban

13 liter térfogatú fermentort az alábbi feltételek mellett üzemeltetünk: 30 °C inkubálési hőmérséklet, a keverő fordulatszáma 600 perc*1, tápfolyadék az le) példa szerinti, levegőztetés 10 liter/perc, beoltás az lb) példa szerint készített előtenyészet 500 ml-ével. A termelés optimuma a 96-120. órában következik be. Az (1), (2) és (3) vegyület összhozama mintegy 400 mg/liter.

3. példa

Az (1), (2) és (3) jelű vegyület elkülönítése

A DSM 3813 jelű termelő törzs tenyészetének szűrletéből 4 litert liofilizálunk, és a kapott 60 g anyagot 3x1 liter metanollal extraháljuk 5-6 pH mellett. A metanolos extraktumot vákuumban bepároljuk. A maradékot metanol és viz 9:1 arányban készitett elegyében oldjuk, és az oldatot több részletben Sephadex LH 20 adszorbensen a fenti koncentrációjú vizes metanollal kromatografáljuk. Az (1) és (2) vegyület először együtt jelenik meg elnyúlt sárgás-vöröses barna zóna, amelyet barnavórös zónaként követ a (3) vegyület. A több oszlopról származó (l)+(2) frakciókat újabb Sephadex LH 20 oszlopon metanollal kromatografáljuk, a (2) vegyület az (1) vegyület előtt eluálódik. Az elegy feloldása során a (2) vegyület nagyobbik része oldhatatlan maradékként kiszűrhető. Összesen 70 mg piroB, amorf (1) vegyületet és 14 mg sárga, részben kristályos (2) vegyületet kapunk. A (3) vegyületet is tartalmazó frakciókat preparativ vastag Kieselgél rétegen (20 x x 20 cm) még egyszer kromatografáljuk etil-acetát/metanol/víz 6:2:1 aárnyú elegyével. A narancsszínű főzónát kloroform és metanol 1:1 arányú elegyével eluáljuk; Sephadex LH 20 adszorbensen vegytiszta metanollal végzett további tisztítás után 7,5 mg (3) jelű vegyületet kapunk.

4. példa

A (2) jelű vegyület metilészterének előállítása

10 mg (2) jelű vegyületet 20 ml frissen készített 5 mólos metanolos sósav-oldatba adagolunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 24 órán át keverjük, majd vákuumban bepóroljuk. A maradékot LH 20 Sephadex-en metanol és kloroform 9:1 arányú elegyével kromatografáljuk. 5,5 mg (2)-metilésztert kapunk.

5. példa

Az (1) vegyület dimetilészterének előállítása

50 mg (1) vegyületet 15 ml frissen készitett 5 mólos metanolos sósavval 24 órán át szobahőmérsékleten keverünk. Vákuumban végzett bepárlás után a maradékot Sephadex LH 20 oszlopon (2,5 x 40) kromatografáljuk metanollal. 29 mg (l)-dimetilésztert kapunk.

Az (1), (2) és (3) vegyület spektroszkópiai adatai

Vegyület

R1

Rí

R3

(1)-OH

(a) képletű

H

csoport

(2)-OH

H-OC-CH3

(3)-NH2

H

H

(1)

(2)

(3)

UV [nm]

428

402

429

254

250

256

IR [cm*1]

3390

3425

3420

(KBr)

3305

1725w

3295s

3325

1692m

1687m

1640m

1618s

1580

1588

1590s

1555

1510s

1562

1393s

(1)

3H-NMR: 200 MHz,

ds-DMSO

= 1,80

(s, 3H);

3,17

(d, 2H); 4,35 (dd,

1H);

6,48 (s,

1H);

7,22

(breit, NH2);

7,63

(d, 1H);

8,04

(dd,

1H); 8,25 (d,

NH);

8,30 (d,

1H) ppm

13C-NMR: 50 MHz, CD3OD

= 22,9

(CH3);

37,5

(CHz);

56,6 (CH);

102,1

(C-l);

105,0

(C—4);

116,2 (C-6);

130,7

; 131,9

(C-7,

C-9);

134 (C-9a);

136,3

(C—8);

144,9

(C-5a); 147,8 (C-10a)

; 151,2

(C-4a);

152,2 (C—2);

173,0

; 173,6

(C-4’,

C-5’

); 177,1 (C-3); :

180,5 (C-1’) ppm

(2) 41-NMR: 200 MHz, 60 °C, ds-DMSO

= 2,25 (s, 3H); 6,52 (s, 1H); 7,57 (d, ÍH); 8,16 (dd, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,32 (d, 1H); 9,65 (1H, NH) ppm

13C-NMR: 50 MHz, 60 °C, ds-DMSO

= 24,1 (CH3); 103,9; 113,0; 115,4; 129,8; 132,1; 132,7; 137,5; 144,5; 148,4;

148,9; 166,0; 170,2; 179,2 ppm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

5