201354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fenoxazinon-származékok előállítására mikrobiólogiai úton
1 HU 201354 B 2 A találmány tárgya eljárás farmakológiailag hatásos fenoxazinon-származékok mikrobiológiai úton történő előállítására. Talajmintából izolálták a Német Mikroorganizmus Gyűjteménynél DSM 3813 szám alatt letétbe helyezett Streptomyces törzset, amely a következőképpen jellemezhető: spórafelület Sm spórák morfológiája Rf kromogenitás M+ légmicélium szine szürke Szén- és nitrogénforrást, valamint a szokásosan használt szervetlen sókat tartalmazó tápoldatban a DSM 3813 sz. törzs fenoxazinon-vázú új vegyületeket termel, amelyek tehát az említett törzs fermentálása útján előállithatók és a micéliumból, főleg azonban a tenyészközegből kinyerhetők. Ismert, hogy aktinomycetes-ek amino-fenoxazinont képesek termelni [Gerber et al.: J. Antibiot. 36(6), 688 (1983); Gerber, N.N: J. org. Chem. 32, 4055 (1967)]. Az alábbiakban megnevezett, mikrobiológiailag előállított fenoxazinon-származékok azonban újak. Az új vegyületek gombák és viruBok ellen aktivak, anthelmintikus és lipoxigenáz-gátló hatásuk van, tehát gyógyászati készítmények alakjában a humán és állatgyógyászatban, illetve a diagnosztika területén alkalmazhatók. Az új vegyületek az (I) általános képletnek felelnek meg, ahol R1 jelentése -OH csoport vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport, R2 jelentése (a) képletű csoport és R3 jelentése hidrogénatom, vagy Rl jelentése -OH csoport vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport, R2 jelentése hidrogénatom és R3 jelentése -COCH3 csoport vagy R1 jelentése -NH2 csoport, R2 jelentése hidrogénatom és R3 jelentése hidrogénatom. A már említett Gerber-cikkben (J. Antibiot. 36(6) 688. old., 1983) szereplő vegyület olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben R1 = -OC2H5, R2 s R3 = H. Ismert továbbá egy hasonló vegyület (Berichte 29, 1758), amelyben R1 = OH, R2 = R3 = H. A találmány szerint az új vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a DMS 3813 sz. Streptomyces törzset tápközegben tenyésztjük, majd kívánt esetben a vegyületeket kinyerjük és kémiai úton az R1 helyén -OH csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket észterezzük. A DMS 3813 sz. Streptomyces törzs helyett természetesen e törzs mutánsait és variánsait is alkalmazhatjuk, amennyiben ezek szintén termelik a fent felsorolt három vegyületet. Mutánsok ismert módon, így fizikai eljárással, például ultraibolya fénnyel vagy röntgensugarakkal végzett besugárzás, vagy kémiai mutagén anyagokkal, igy etán-szulfonsav-metilészterrel (etil-metilszulfonát, EMS) vagy 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenonnal (MOB) végzett kezelés útján állíthatók elő. Az aerob módon történő fermentálás során szénforrásként asszimilálható szénhidrátok és cukoralkoholok, így glükóz, laktóz vagy D-mannit, valamint szénhidrát-tartalmú természetes anyagok, például malátakivonat alkalmazható. Nitrogéntartalmú tápanyagként az alábbiak jöhetnek számításba: aminosavak, proteinek és bomlástermékeik, igy peptonok és triptonok, továbbá húskivonatok, darált magvak (például kukorica, búza, bab, szója, gyapot), az alkoholipar desztillációs maradékai, húslisztek vagy élesztőkivonatok, de ammóniumsók és nitrátok szintén alkalmazhatók. Egyéb szervetlen sóként a tápközeg például alkáli- vagy alkáliföldfémek, vas, cink és mangán kloridjait, karbonátjait, szulfátjait vagy foszfátjait tartalmazhatja. Különösen kedvezően zajlik a három vegyület képződése, ha a tápközeg - tömegére vonatkoztatva - mintegy 2X szójalisztet és 2% mannitot tartalmaz. A fermentálást aerob módon, tehát például rázott vegy kevert süllyesztett tenyészetben, vagy adott esetben levegőztetett fermentorban végezzük. A fermentálás hőmérséklete mintegy 18-35 °C, előnyösen mintegy 25-30 °C, különösen előnyösen 28-30 °C. A pH érték 5 és 8,5, előnyösen 5,5 és 8,0 közötti érték. E körülmények között általában 2-6 nap elteltével a fermentálással nyerhető három vegyület kezd feldúsulni. Előnyös, ha több lépcsőben végezzük a fermentálást, azaz először egy vagy több előtenyészetet készítünk folyékony tápközegben, és az előtenyészetet - például 1:10 térfogatarányban - átoltjuk a tulajdonképpeni termelő tenyészetbe. Az előtenyészetet például úgy készítjük, hogy spórás micéliumot teszünk a tápoldatba és ott 48-72 órán át nőni hagyjuk. A spórás micéliumot pedig úgy kapjuk, hogy a törzset szilárd vagy folyékony tápközegen, például élesztó-maláta-agaron kb. 7 napon keresztül tenyésztjük. A fermentáció alakulását a pH érték vagy a micélium tömeg alapján követhetjük. A fermentációs úton előállított három vegyületet ismert módon kinyerjük, és a kinyert termékek kémiai, fizikai és biológiai tulajdonságaik figyelembevételével történik. Előnyös, ha a feldolgozás megkezdése előtt Kieselgélen vékonyréteg-kromatogramot készítünk valamilyen poláros oldószerrel vagy oldószereleggyel, például n-butanol, ecetsav és víz elegyével. A vegyületeket a nem szűrt tenyészléból vízzel nem vagy csak kevéssé elegyedő szerves oldószerrel, így n-butanollal vagy acetonnal extraháljuk, célszerűen 5 és 6 közötti pH mellett, de lehetséges a tenyészlé liofilizálása és a liofilizált anyag metanollal vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
