201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
5 HU 201350 B 6 magában, ez normálisan kb. 4 kb-t meg nem haladó hosszúságú, előnyösen nem több, mint kb. 2,5 kb hosszúságú és különösen előnyösen nem több, mint kb. 2 kb hosszúságú. Amikor a beiktatott DNS fragmens az RÍ par B területet foglalja magában, ez normálisan kb. 2 kb-t meg nem haladó hosszúságú, előnyösen nem több, mint kb. 1,5 kb hosszúságú és különösen előnyösen nem több, mint 1 kb hosszúságú. A kis DNS fragmensek fentebb jelzett előnyős volta azonban nem zárja ki azt a lehetőséget, hogy a plazmidot a teljes EcoRl-A fragmens beépítésével stabilizáljuk; ez pl. akkor lehetséges, amikor a stabilizálandó plazmid mérete kevésbé kritikus. Ha a fragmenst teljes egészében iktatjuk be, előnyös lehet átvizsgálási célok miatt olyan DNS fragmenst alkalmazni, amely antibiotikum rezisztenciát közvetítő génnel rendelkezik. Ha azonban bizonyos okból kívánatos az EcoRl-A fragmens méretét csökkenteni, ezt különböző utakon lehet végrehajtani, pl. az EcoRl-A fragmens részleges restrikciójával Pst I restrikciós enzim segitségével, vagy úgy, hogy az RÍ par területeket a nagy fragmenstől levágjuk, és a területeket egymás után ugyanabba a DNS fragmensbe átvisszük, amelyet azután a stabilizálandó plazmidba beiktatunk. A találmány szerinti módon stabilizált plazmidok lehetnek vagy olyan plazmidok, amelyek természetes rokonságban vannak a beiktatott megosztó területtel, mint pl. RÍ miniplazmidok, amelyeket egy beiktatott RÍ par terület segitségével stabilizálunk (az RÍ miniplazmidokból el van távolítva sok eredeti RÍ DNS, következésképpen önmagukban általában nem tartalmaznak RÍ par területet), vagy olyan plazmidok lehetnek, amelyeknek nincs természetes rokonságuk a megosztási funkcióval. Érdekes megemlíteni, hogy a találmány szerint hasznos, hatásos megosztási funkció nem csupán azoknak a plazmidoknak a kielégítő stabilitását képes biztosítani, amelyekkel természet szerint rokon, mint pl. az RÍ miniplazmid stabilizálása esetében egy RÍ par területtel, hanem olyan plazmidoknak is, amellyel a megosztási funkciónak nincs természet szerinti rokonsága. Az utóbbira példa egy RÍ par terület beiktatása egy nem-Rl plazmidba, mint pl. egy pMBl plazmidba vagy annak származékába, pl. pBR 322 plazmidba vagy annak származékába (ezek a plazmidok rendesen stabilak, de hajlamosak nem-stabillá válni, amikor a plazmiddal természet szerint nem rokon gént vagy géneket iktatnak beléjük). Egy másik példa egy RÍ par terület alkalmazása bizonyos plazmidtipusok stabilizálására, amelyek a plazmidot befogadó baktériumok tenyésztésének legalább egy szakaszában, kis kópiaszámmal rendelkeznek, pl. 0,5-5 kópia sejtenként, ilyenek a kis kópiaszámú, széles gazdatartománnyal rendelkező plazmidok [olyan plazmidok, amelyek képesek replikálódni több különböző gazdatörzsben vagy fajban; ide tartoznak az úgynevezett .ingázó" (shuttle) vektorok, amelyek két vagy több típusú mikroorganizmusban képesek replikálódni és származékaik, pl. az RK2. A stabilizálást igénylő Inc F II összeférhetetlenségi csoportba tartozik az RÍ plazmidon kivül az R100 és R6 is. Egy RÍ par terület alkalmazása nem stabil F plazmidok stabilizálására szintén a jelen találmány oltalmi körébe esik. A találmány szerinti stabilizálás fontos az úgynevezett feltételesen .megvaduló" replikációs plazmidok esetén, azaz olyan plazmidok esetén, amelyek abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó gazda mikroorganizmust bizonyos körülmények között tenyésztjük, konstans kis plazmid kópiaszámot mutatnak, míg abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó mikroorganizmust bizonyos más körülmények között tenyésztjük, elvesztik replikációs szabályozásukat, és a plazmid kópiaszáma exponenciálisan növekszik mindaddig, amíg a gazdasejt meg nem szűnik növekedni. A .megvaduló" (.runaway") replikációs plazmidok, amelyek esetén a találmány szerinti stabilizálás különösen létfontosságú, az olyan plazmidok, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 3-5-öt sejtenként, és különösen azok, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 0,5-1 kópiát sejtenként (a 0,5 szám úgy értendő, hogy a replikációs gyakoriság kevesebb, mint 1 sejt-ciklusonként), abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek ilyen kis plazmid kópiaszámot biztosítanak, mig abban az esetben, ha a gazda mikroorganizmust bizonyos más körülmények között tenyésztjük, amelyek egy lényegesen megnóvekedett plazmid kópiaszámot biztosítanak legalább 500-1000 kópia/sejt kópiaszámot mutatnak. A bizonyos körülmények közötti (általában alacsony hőmérsékleten, kb. 30 °C körüli hőmérsékleten) kis plazmid-kópiaszám akkor kívánatos, amikor plazmidot használunk vektorként olyan idegen gének beiktatására, amelyek a gazdasejtre részben toxikus vagy letális termékeket kódolnak, mivel a plazmid pl. alacsony hőmérsékleten kis sebességgel replikálódik, a gének csupán kis mennyiségben fejeződnek ki, ha egyáltalán kifejeződnek, igy a sejtek nem károsodnak a tenyésztés sokszorozódási szakaszában. Az ilyen rendkívüli kis kópiaszámmal rendelkező plazmidokban azonban - amely kis kópiaszám a fentebb említett sokszorozódási szakasz körülményei között, pl. alacsony hőmérsékleten történő tenyésztés esetén alakul ki - a par terület hiánya azt eredményezi, hogy a 3-5 kópia/sejt kópiaszámmal rendelkező plazmid a mikrobiológiai populációból generációnként mintegy 1% gyakorisággal elvész, amikor ezeket a sejteket kis kópiaszámot biztosító körülmények között tenyésztjük. A plazmid elvesztésének gyakorisága olyan plazmidok-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
