201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
7 HU 201350 B 8 nál, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 0,5-1 kópia/sejtet, körülbelül 5%/sejt/generáció. Nyilvánvaló, hogy valamiféle megosztási funkció nélkül, amely stabilizálja ezeket, a plazmid eltűnhet a sejtekből, mielőtt a sejtek elérnék azt a sűrűséget a tápkőzegben, amely gazdaságos lenne a .megvaduló' replikáció beindításához; ez különösen fontos nagy mennyiségű termelés esetében, amikor a sejt több száz generációja szükséges, hogy elérjük a termelő méretű tenyészetet. Az ilyen .megvaduló" replikációt feltételessé lehet tenni egy szabályozható promoter beiktatásával a plazmid eredeti replikációs szabályozó génje(i)vel ellenkező irányban (ennek a részletes leirása megtalálható jelen bejelentők ezzel a bejelentéssel összefüggő másik bejelentésében, amelynek címe: .Feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok’, és amelyet ugyanazon napon nyújtottak be, mint a jelen bejelentést). Számos különböző típusú plazmid lehetséges, amely .megvaduló" replikációs viselkedéssel rendelkezik, de az előnyös .megvaduló" replikációs plazmidok az Rl-típusú plazmidok. A jelen értelmezésben a .stabilitás" (és az ezzel rokon kifejezések) azt kívánják jelenteni, hogy a gazdasejtból a plazmid elvesztésének gyakorisága kevesebb, mint 2 • • 10*4 (sejt) generáció. Valójában egy Par funkció beiktatásával a plazmidba lehet olyan plazmidokat is nyerni, amelyek éppen olyan stabilak, mint a vadtípusú plazmidok, azaz az elvesztésük gyakorisága kevesebb, mint 3 ■ • 10*6 (sejt) generáció, amely megfelel a gének mutációs gyakorisági szintjének. Ez utóbbi elvesztési gyakorisági (LF) érték akkor valósul meg, amikor a plazmidot mind RÍ par A területtel, mind RÍ par B területtel stabilizáljuk, mint pl. amikor a teljes EcoRl-A fragmenst beiktatjuk a plazmidba. Amint korábban említettük, az RÍ plazmid Par* fenotipusa viszont az EcoRl-A fragmensen elkülönült par területeken helyezkedik el. Úgy találtuk, hogy ezeknek a par területnek mindegyike stabilizáló hatást fejt ki a nem stabil plazmidokra, amely plazmidokat úgy is meghatározhatjuk, mint stabilizáló- vagy megosztási funkció-hiányos plazmidokat. Az ilyen plazmidok, amelyek fenotipusosan Par* típusúak, általában kisebb vagy nagyobb gyakorisággal elvesznek a gazdasejtből; igy pl. az RÍ plazmid származékok, amelyekből a par terület hiányzik, mintegy 1,5 • 10*2 (sejt) generáció gyakorisággal 5 vesznek el a gazdasejtből. Hasonlóképpen a pl5 plazmid származékok, amelyek Par* típusúak, kb. 1 • 10*2 (sejt) generáció gyakorisággal tűnnek el, és néhány pMBl plazmidszármazék (pBR 322) (pl. egy olyan, amelyet 10 a 3.3 példában leírunk), 6 • 10*3 (sejt) generáció gyakorisággal tűnhet el. Ezzel szemben a vagy par A-val, vagy par B-vel stabilizált RÍ plazmidok kb. 10*4/sejt/generáció LF-értékkel rendelkeznek, ez százszoros sta- 15 bilizálásnak felel meg, amely egy nem-stabil vektorba beiktatott, ezeknek a par területeknek valamelyikét hordozó DNS fragmensnek tulajdonítható; ugyanezek a számok a megfelelő pl5 származéknál kb. 8 • 10*4 (Par 20 A*), 1 • 10*6 (Par B*), a megfelelő pMBl származéknál 5 • 10*5 (Par B*). Az olyan plazmidok, amelyek mind a par A, mind a par B területet hordozzák, kb. 10**/sejt/generáció LF-értékkel birnak, vagyis egy 104- 25 -szeres stabilizáló hatásról van szó. A könynyebb áttekintés érdekében a különböző eredetű stabilizált és nem stabilizált replikonok eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. Ez azt jelzi, hogy mindegyik par terület a 30 másiktól függetlenül működik, valamint azt, hogy a par területek hozzávetőlegesen egyformán hatásosak a stabilizálásban, legalábbis az RÍ és pl5 plazmidoknál, és azt, hogy ténykedésük és hatásuk összeadódik. Ezt a 35 jelenséget akkor lehet hasznosítani, amikor meghatározzuk azt a mértéket, amelyre egy nem-stabil plazmidot stabilizálni kell. Ha kevésbé drasztikus stabilizálás szükséges, azaz ha úgy becsüljük, hogy a stabilizálandó 40 plazmid nem túlságosan labilis [kisebb, mint 10*2/sejt/generáció LF-értékű], elegendő beiktatni egy olyan DNS-fragmenst, amely a par területeknek csak egyikét tartalmazza, igy is kielégítő stabilitást lehet elérni, azaz 45 olyan stabilitást, amely elejét veszi a plazmidok fokozatos elvesztésének nagy-méretarányú baktériumpopuláció előállításánál több száz generáción keresztül. Másrészt viszont ha a plazmid nagyon kevéssé stabil [na- 50 gyobb, mint 10*2/sejt/generáció LF-értékű], szükséges vagy legalábbis előnyös mindkét par területet beiktatni, hogy biztosítsuk a plazmidok rendkívüli stabilitását. i. Táblázat Különböző replikonok veszteség/sejt/generáció gyakoriságai A replikon típusa A veszteség gyakorisága (10*4/sejt/generáció) Par fenotípus Par* Par A* Par B* Par A* Par B* RÍ 150 0,6 1,0 0,04 pl5 100 8,0 0,01 0,01 pMBl (pBR 322) 60 ND1 0,5 0,1 *ND = nincs adat 6
