201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
3 4 HU 201350 B A leírásban a .megosztási funkció' olyan funkciót jelent, amely a plazmidmolekulák rendezett elosztását biztosítja sejtosztódásnál, és amelyet a plazmidnak egy olyan területe kódol, amely - a funkciót kifejező plazmid típusától függően - egy vagy több génből áll. Amint korábban említettük, ilyen területeket találtak a természetben előforduló vagy vad típusú plazmidokban; de az olyan plazmidok, amelyek egy Par* fenotipust fejeznek ki, vagyis amelyekben a megosztó gének jelen vannak, és ugyanakkor a plazmidokkal természet szerint nem rokon beiktatott gént vagy géneket is hordoznak, újnak tekinthetők. Ebben a szövegben a plazmidokat úgy határozzuk meg, mint természetben előforduló extrakromoszomális elemeket a mikroorganizmusokban, amely elemeket önmagukban vagy származékaikként izolálni lehet. A találmány szerinti plazmidok a rekombináns DNS technológia területén klónozó vagy termelő vektorként alkalmazhatók abból a célból, hogy technikai vagy orvosi célú termékek széles választékát nyerjük, amelyek előállítását közvetve vagy közvetlenül a beiktatott gén vagy gének közvetítik, ilyen termékek elsősorban a polipeptidek, peptidek vagy ezek fragmensei, enzimek, az enzimek reakcióinak nagy számú nem-fehérjeszerű termékei, olyan kis molekulatömegű termékek, mint hormonok és nukleinsavak; különösen jelentősek az eukarióta, elősorban az emlős gének termékei. A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módja értelmében a megosztási funkció egy olyan funkció, amelyet a természetben Rí vadtípusú rezisztencia plazmid területe fejez ki, és ezért a továbbiakban ezt RÍ par területnek fogjuk nevezni. A jelen találmány szerint egy ilyen területről azt találtuk, hogy részleges vagy teljes stabilitást idéz elő nemcsak a plazmiddal természet szerint nem rokon gént vagy géneket hordozó nem-stabil RÍ miniplazmidoknál, hanem a plazmiddal természet szerint nem rokon gént vagy géneket hordozó, RÍ plazmiddal nem rokon, gyakran kiválasztódó plazmidoknál is. Egy másik példa a különösen értékes megosztási funkcióra az, amelyet a vadtípusú F plazmidra találtak (Seelke és munkatársai, fentebb idézett munka), amely szintén nagy mértékű stabilitást ad a befogadó plazmidnak. A következőkben elsősorban az RÍ Par funkcióra hivatkozunk, de belátható, hogy a legtöbb jelenség, amely az RÍ Par funkcióval kapcsolatos, más Par funkciókra is érvényes, és hogy a találmány nem korlátozódik csupán az RÍ Par funkcióra. Azt mér korábban jelezték, hogy az RÍ plazmid megosztási funkcióját az úgynevezett EcoRl-A fragmens fejti ki (Nordström és munkatársai, Plasmid, 4, 1980, 332-49 oldal). A jelen találmányhoz vezető kutatás folyamán meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az EcoRl-A fragmes, amely Kb. 19 kb (19000 bázispár) hosszúságú, két és csak két elhatárolható területet tartalmaz, amely Par* fenotipust ad a befogadó plazmidnak. Ezek a területek az EcoRl-A fragmens egyik végén 5 helyezkednek el, és nincs olyan más DNS szekvencia az EcoRl-A fragmensben, amelyről jelenleg úgy hinnénk, hogy bármiféle plazmidstabilizáló funkciója van. A jelen célokra a két területet par A és par B területnek 10 nevezzük, és a későbbiekben rövidítve csak par A-nak és par B-nek jelöljük. Előnyős olyan kis DNS fragmensekkel dolgozni, amilyen kicsikkel csak lehetséges, mivel a kis fragmensek beiktatása könnyebb 15 a plazmidba, és az így kialakult plazmidot is könnyebb transzformálni a gazdasejtbe; ezért a jelen találmány egyik tárgya eljárás olyan plazmid előállítására, amely olyan beiktatott DNS fragmenst hordoz, amely rövidebb, mint 20 az RÍ plazmid EcoRl fragmense, és tartalmazza az RÍ par területet. Ez a beiktatott DNS fragmens normálisan főkomponensként tartalmazza az RÍ par terület A területét, vagy az RÍ par terület B területét, vagy mind az RÍ 25 par terület A, mind az RÍ par terület B területét. Ez azt jelenti, hogy lényegileg mindegyik, a gazdaplazmidba beiktatott DNS fragmens vagy egyik, vagy mindkét par területből van kialakítva, és a fragmenseken levő 30 többi DNS elsősorban azért van jelen, hogy megfelelő restrikciós helyeket szolgáltasson, és olyan DNS fragmensek alakuljanak ki, amelyek a megkívánt végekkel rendelkeznek, amely végek könnyen összeférhetók a befo- 35 gadó plazmidon levő megfelelő vagy összeférhető restrikciós helyekkel. Ilyen végeket kapcsolók segítségével is ki lehet alakítani. A par A területet tartalmazó DNS fragmenst és a par B területet tartalmazó DNS frag- 40 menst lehet külön-külön, egymás után is bevezetni ugyanabba a plazmidba, amely azután fenotípusosan azonos lesz egy olyan plazmiddal, amelyben a Par A*, Par B* fenotípus az ugyanabban a DNS fragmensben levő par A 45 terület és par B terület beiktatásával alakult ki. így pl. ha egy olyan plazmidot kívánunk tovább stabilizálni, amely már hordoz egy par területet, pl. a par B területet, a plazmidot el lehet hasítani egy megfelelő 50 restrikciós enzimmel, és egy olyan DNS fragmenst lehet ide beiktatni, amelynek végei összeférhetók ezzel a restrikciós hellyel, és amely hordozza a másik par területet, jelen példában a par A területet. Egy par B terü- 55 let beiktatását hasonló módon egy olyan plazmidba, amely már hordoz egy par A területet, szintén lehet alkalmazni. Az eddigiekkel összhangban azok az érdekesebb plazmidok, amelyekben az RÍ par A 60 területet és RÍ par B területet tartalmazó beiktatott DNS fragmens hossza nem haladja - meg a kb. 6 kb-t, előnyösen nem haladja meg a 4 kb-t és különösen előnyösen nem haladja meg a 3 kb-t. Amikor a beiktatott 65 DNS fragmens az RÍ par A területet foglalja 4
