201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására
1 2 HU 201349 B A találmány tárgya eljárás cefalosporin C-vel szemben hatásos tiszta D-aminosav-oxidáz előállítására. Az aminosav-oxidáz alkalmazására tartós igény áll fenn oC-ketosa vaknak a megfelelő 5 aminosavakból való előállításához, ugyanis az oC-ketosavak a veseelégtelenségben szenvedő betegek táplálék-kiegészítésére fontosak. Mind a Trigonopsis variábilis élesztőben talált D-aminosav-oxidáz aktivitást [Brodelius, 10 P., Nilsson, K. és Mosbach, K; Appl. Biochem, Biotechnoi. 6, 293-308, (1981)], mind a Providencia baktériumban talált L-aminosav-oxidáz aktivitást [Szwajcer, E., Brodelius, P. és Mosbach, K., Enzyme Microb. Technoi. 4, 409- 15 -413 (1982)] felhasználták. A D-aminosav-oxidáz a cefalosporin C-re is hat, azt oxidativ dezaminálással keto-adipil-7-amino-cefalosporánsavvá alakítja. Hasonló aktivitást Írtak le a 3 658 649 számú amerikai egyesült államok- 20 beli szabadalmi leírásban. Az alkalmazott extraktum azonban csak ammónium-szulfátos lecsapással nyert nyerstermék volt, amely többféle aminosav-oxidázt tartalmazott. Aminosav-oxidáz aktivitásuk szempontjá- 25 ból számos különféle mikroorganizmust vizsgáltak meg. Ezek közé tartoznak az E. coli, Pseudomonas species, Aerobacter species, Candida tropicalis, Penicillium rocforti, Aspergillus flavus és A. niger, Neurospora 30 crassa, Nocardia, Citrobacter és a Trigonopsis variábilis. Közülük csak a Trigonopsis variábilist és a Citrobactert találták képesnek cefalosporin C keto-adipil-7-amino-cefalosporónsavvá való dezaminálására. A Citro- 35 bacterben az aktivitást igen gyengének találták, úgy vélik, hogy ez az aktivitás membránhoz kötött, mig a Trigonopsis enzimaktivitása jóval nagyobb és a citoplazmában található. 40 Megemlítjük még, hogy cefalosporin C-re ható enzimet sertés veséből is kinyertek [Mazzeo, P. és Romeo, A.; J.C.S.Perkin I(P3), 2532 (1972)]. A 7-amino-cefalosporánsav ipari szem- 45 pontból igen fontos, mivel a szemiszintetikus cefalosporinok előállításának alapjául szolgál hasonlóképpen ahhoz, amint a 6-amino-penicillinsav a szemiszintetikus penicillinekéhez. A szakirodalomból ismert egy olyan aci- 50 láz, amely a glutaril-7-amino-cefalosporánsav oldalláncát hidrolizálja [Shibyva, Y., Matsumoto, K. és Fuji, T,; Agr. Bioi. Chem. 45, 1561-1567, (1981)]. A glutaril-7-amino-cefalosporánsav a keto-adipil-7-amino-cefalospo- 55 ránsavból egyidejű hidrogén-peroxid képződés mellett spontán jön létre. A 1. reakcióvázlatban bemutatjuk a 7-amino-cefalosporánsav keletkezését Cefalosporin C-ből D-aminosav-oxidáz és aciláz enzimek hatására. A találmány tárgya eljárás cefalosporin C-re ható Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáznak lényegében tiszta formában való előállítására. A Trigonopsis variábilis élesztő különféle törzsei számos törzsgyűjteményben hozzáférhetőek, például az NRRL Y-1579, az ATCC 10679, illetve CBS 4095 számon szerepelnek a megfelelő törzskatalógusokban; vizsgálatainkat Trigonopsis variábilis CBS 4095 törzzsel (Central Bureau voor Schimmelculture Baarn, Hollandia) végeztük. A találmány tárgya még egy a D-aminosav-oxidáznak Trigonopsis variábilisból való izolálására szolgáló eljárás is. A D-aminosav-oxidáznak homogenitásig való tisztítására alkalmas találmány szerinti egyszerű eljárás három lépésből áll. Ezek a következők; i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktuumát megsavanyitva és melegítve csapadék és felülúszó frakciókra bontjuk, kivánt esetben az extraktumhoz melegítés előtt enzimvédő anyagot adunk, ii) az i) lépésben kapott felülúszó frakciót - kivánt esetben dialízis és bepárlás után - megfelelő mennyiségű ammónium-szulfáttal kezelve második csapadékfrakciót nyerünk, amely csapadék a cefalosporin C-re ható D-aminosav-oxidázt tartalmaz, majd iii) a ii) lépésben kapott csapadékot újra szuszpendáljuk, és a szuszpenzióból a D-aminosav-oxidázt kívánt esetben dialízist követően izoelektromos lecsapással kinyerjük, és kívánt esetben tovább tisztítjuk. A fenti i) lépés szerinti savanyítást elvégezhetjük ecetsavnak a nyers sejtextraktumhoz való adagolásával. A sejtextraktumot pH 4 és 6 közé, előnyösen pH 5,1 és 5,3 közé, még előnyösebben pH 5,3-ra savanyítjuk. A találmány egy másik megvalósitási módjánál a savanyítás után, a melegítést megelőzően minden képződött csapadékot eltávolítunk. Továbbá a melegítést megelőzően adagolhatunk a meg savanyított sejtextraktumhoz D,L-metionint is, előnyösen olyan mennyiségben, hogy végkoncentrációja 25 mmól/1 körüli legyen. A nyers extraktumot az i) lépés szerinti kezelés során 40-60 °C-ra előnyösen 40- -50 °C-ra, még előnyösebben 50 °C-ra melegítjük. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az i) lépésben kapott felülúszót az ammónium-szulfáttal való kezelést megelőzően dializáljuk, előnyösen pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk. Egy további előnyös megvalósítási mód szerint az i) lépésben kapott felülúszót az ammónium-szulfáttal való kezelést megelőzően dializáljuk és bekoncentráljuk. A bekoncentrélást előnyösen bepárlással végezzük. Az ammónium-szulfátos kezelést egy előnyös megvalósitási forma szerint a következő módon végezzük: i) a felülúszó frakcióhoz körülbelül 30 tömegX koncentráció eléréséig ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot eltávolítjuk és 3
