201349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-aminosav-oxidáz előállítására
3 HU 201349 B 4 ii) a felülúszóhoz az 55 tömeg% körüli koncentráció eléréséig további ainmónium-szulfátot adagolunk, majd a kapott csapadékot összegyűjtjük. A D-aminosav-oxidázt tartalmazó második csapadékot a iii) lépésben az izoelektromos lecsapással való elkülönítést megelőzően dializálhatjuk, a dialízist előnyösen pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben végezzük. Az izoelektromos kicsapás során i) az előzőekben említett második csapadékot pH 5,1-es 25 mmól/l-es nátrium-acetáttal szemben dializáljuk, majd a dializálás után visszamaradó minden csapadékot eltávolítunk, és ii) az i) lépésben kapott oldatot pH 4,6- -os, 100 mmól/l-es nátrium-acetáttal szemben dializáljuk és a kapott tisztított D-aminosav-oxidáz csapadékot összegyűjtjük. Az izoelektromos lecsapással kapott D-aminosav-oxidázt gélelektroforézissel tovább tisztíthatjuk.. A találmány szerint a D-aminosav-oxidázt immobilizált formában, előnyösen cianogén-bromiddal aktivált Sepharose-hoz kötve is előállíthatjuk. A találmány egy további megvalósítási módja a következő: i) a Trigonopsis variábilis sejteket elroncsolva nyers extraktumot készítünk, majd ezt megsavanyitjuk; ii) a megsavanyitott nyers extraktumot 50 °C hőmérsékletre melegítjük, a képződött csapadékot eltávolítjuk és a felülúszót dializáljuk; iii) a ii) lépésben kapott felülúszót ammónium-szulfáttal kezeljük és a kapott csapadékot dializáljuk, majd iv) a D-aminosav-oxidázt izoelektromos kicsapással elkülönítjük. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a következő módon járunk el: i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot ecetsavval pH = 5,3-ra savanyítjuk, miközben az extraktum csapadékra és felülúszóra válik el; ii) a felülúszóhoz 25 mmól/1 végkoncentrációig D,L-metionint adunk; iii) a felülúszót 50 °C-ra melegítjük és tiz percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, miközben egy második csapadék és felülúszó képződik; iv) a iii) lépésben kapott felülúszót pH = 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát pufferrel szemben dializáljuk; v) a iv) lépésben kapott oldathoz 30% vég koncentrációig nátrium-ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot eltávolítjuk; vi) a v) lépésben kapott oldathoz 55% végkoncentrációig szilárd ammónium-szulfátot adunk, és a képződő csapadékot összegyűjtjük; vii) a vi) lépésben kapott csapadékot először pH = 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát pufferrel, majd pH = 5,1-es, 25 mmól/l-es nátrium-acetát pufferrel szemben dializáljuk, és a dializálás után visszamaradó csapadékot eltávolítjuk, majd viii) a vii) lépésben kapott oldatot pH = 4,6-os, 100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, majd összegyűjtjük a kapott, D-aminosav-oxidázt tartalmazó csapadékot. A találmányt a későbbiekben ismertetésre kerülő példák és az ábrák segítségével részletesebben is bemutatjuk. Az 1. ábrán a tisztított D-aminosav-oxidáz poliakrilamidgél elektroferogramja látható. 25 ng tiszta fehérje nátrium-dodecil-szulfátos (SDS) rendszerben való gélelektroforézisével egy frakciót kapunk. (A gél bal oldalán látható kisebb sötét sáv a két különböző gél érintkezésének határvonala.) A gélhez adott jelzófestéket a fehérje festése előtt eltávolítottuk a gélről. A 2. ábrán a Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz molekulatömeg meghatározásának eredményét mutatjuk be. Az SDS gélelektroforézist 12%-os poliakrilamidgélen végeztük Laemmli eljárása szerint [Laemli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)]. A következő standard fehérjéket használtuk: albumin (A; M = 66 000), Ovalbumin (Ov; M =45 000), tripszinogén (Tr; M = 24 000) és lizozim (L; M = 14 500). A 3. ábrán a gélek D-aminosav-oxidáz aktivitásán alapuló festését mutatjuk be. A bemutatott frakció a találmány szerinti eljárás iii) lépéséből származik. A gélek inkubálása a: cefalosporin C-vel, b: D-!eucinnal történt. A vizsgálati módot a kővetkezőkben ismertetjük. Az alkalmazott anyagok és módszerek a következők: Anyagok: A peroxidáz (II típusú, tormából származó), valamennyi aminosav, a cefalosporin C, a dinitro-fenil-hidrazin és az o-dianizidin a Sigma cég (St.Louis, Mo, USA) terméke. Az akrilamid és az N,N’-metilén-biszakrilamid Merck-Schuchardt (München, NSZK) termékek. Az N,N,N’,N’-tetrametil-etilén-diamin, az ammónium-perszulfát és a 0,25 mm szilikagél F254-gyel bevont lemezek a Merck cég (Darmstadt, NSZK) termékei. A növesztő tápközegek a Difco cég (Detroit, USA) termékei. Az oxigénelektródot, a Rank Brothers Bottisham cégtől (Cambridge, Nagy-Britannia) szereztük be. Módszerek: Az analitikai izoelektromos fókuszálást poliakrilamidgélen, I.KB 1804-101 rendszerben végeztük. A hordozó amfolitok pH tartománya 3,5-9,5. Az izoelektromos fókuszálást az LKB-nek a poliakrilamidgélen végzett analitikai elektrofókuszáiáshoz való amfolin poliakril-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
