201338. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azokat tartalmazó gyógyászati készítmények elöállítására
3 HU 201338 B 4 A találmányunk tárgyát képező eljárással az (I) általános képletű peptideket oly módon állíthatjuk elő, hogy a megfelelő nem-szulfatált peptidet valamely szulfatálószerrel reagáltatjuk, majd kívánt esetben a kapott (I) általános képletű formilezett peptidet valamely, a formilcsoport eltávolítására képes szerrel hozzuk reakcióba. Szulfatáló szerként piridinium-acetil-szulfátot (PÁS) vagy kéntrioxid-piridin komplexet alkalmazhatunk. A reakciót 60 °C-on végezhetjük el. A kapott (I) általános képletű szulfátéit peptidet fordított fázisú preparativ HPLC segitségével tisztíthatjuk. Az (I) általános képletű pepiidben levő for mile sopor tot 0,1 n ammónium-hidroxiddal vagy 0,1 n nátrium-hidroxiddal szobahőmérsékleten távolíthatjuk el, majd liofilizálást alkalmazunk. A hasnyálmirigyben és agyban levő receptor-helyekhez kötődő CCK-8-al [Life Sciences 30 (1982) 479., 485-488. oldal] ellentétben az (I) általános képletű peptidek elsősorban a hasnyálmirigyben levő receptor-helyekhez kapcsolódnak. Ezenkívül az (I) általános képletű peptidek a gyomor-bél-rendszerben levő különböző peptidáz-enzimek lebontó hatásának jobban ellenállnak, mint a CCK-8. Következésképpen a találmányunk szerinti eljárással előállítható peptidek hatásukat hosszabb időn át fejtik ki, mint a CCK-8. Az alábbi vizsgálati módszer segitségével a találmányunk szerinti eljárással előállítható peptidek receptorokhoz való speciális kötődését mutatjuk be patkány hasnyálmirigy sejtekből és szarvasmarha striátumból készített homogenizált preparátumokban: az eredményeket a természetes CCK-8 kapcsolódásával hasonlítjuk össze; radioligandként 3H-CCK-8-(S03H)-t alkalmazunk. Mintegy 5 g fagyasztott szarvasmarha striátumot és kb. 5 g friss patkány hasnyálmirigyet pufferben (pH = 7,4) homogenizálunk. A szöveteket 48 000 g mellett 10 percen át 0 °C-on centrifugáljuk, majd újra szuszpendáljuk; 1 rész striátum szövet/80 rész puffer illetve 1 rész hasnyálmirigy szövet/70 rész puffer arányban. Az inkubálást oly módon indítjuk meg, hogy CCK-8-at vagy az (I) általános képletű peptidet különböző koncentrációban 3H-CCK-8-(S03H )-al (végső koncentráció 0,15 nmól) és szövethomogenizá- 5 tummal (striátum ~ 0,26 mg fehérje 2 ml végső térfogatban; hasnyálmirigy ~ 0,165 mg fehérje 1 ml végső térfogatban) kombináljuk. A mintákat 30 percen át 25 °C-on inkubáljuk és az inkubálást az elegy szűrésével befe- 10 jezzük. A szűrőt levegőn szárítjuk, majd 12 ml szcintillációs cocktaillal együtt szcintillációs ampullába helyezzük. Az ampullákat 2 órán át rázatjuk, majd szcintillációs spektrométer segítségével megszámláljuk. A nemspe- 15 cifikus kötődést 1 nmól CCK-8 segítségével meghatározzuk és a specifikus kötés meghatározása céljából valamennyi mintaeredményból levonjuk. A 3H-CCK-8-(S03H) teljes specifikus kötődése 50%-os gátlásához szükséges 20 peptidkoncentrációt (lCso) meghatározzuk. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Két etetési vizsgálat során 180-200 g testsúlyú hím patkányokat 2 napon át éheztetünk, az állatokat lemérjük, egyesével ket- 25 recekbe helyezzük és 4 napos etetési edzést kezdünk meg. Ez alatt az idő alatt a patkányok 9:00 és 10:00 a.m. között csészékben élelmet kapnak; a csészéket 10:00 a.m. és 12:00 p.m. között eltávolítjuk; majd 12:00 és 30 1:00 p.m. között a ketrecekbe visszahelyezzük. A 4. napon a patkányok testsúlyát ismét megmérjük és a kísérletből kizárjuk azokat az állatokat, amelyek testsúlya 5 g-nál jobban csökken. Az állatokat kísérleti- és kont- 35 rollcsoportokba osztjuk. Az oldható (I) általános képletű peptideket nátrium-klorid-oldatban, míg az oldhatatlan peptideket 1%-os gumiarábikumban szuszpendáljuk, 0-32 ug/ml/kg testsúly koncentrációban, majd az ete- 40 tési időszak 5. napján 15 perccel az első etetés előtt intraperitoneálisan beadjuk. A patkányokat ezután ugyanúgy etetjük, mint a megelőző négy napon és a táplálékfogyasztás meghatározása céljából a táplálékot tar- 45 talmazó csészéket minden étkeztetés előtt és után lemérjük. A kezelt csoport táplálékfelvételét összehasonlítjuk a kontrollcsoportéval. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. 1. táblázat Peptid példa száma Szarvasmarha striátum (nM) Patkányhasnyálmirigy (nM) Táplálékfelvétel % 1. étkezés 2. étkezés 1. 1000 9.4 23 ± 13 55 ± 10 2. 100, 500 2.2 8 t 1 26 t 4 3. 100 100 34 ± 6 164 i 16 4. 100 44 5 í 5 79 ± 13 5. 4100 4200 70 ± 2 133 t 9 6. 1750 100 14 ± 6 114 ± 9 7. 1000 14.5 17 95 CCK-8 1-4, 6 1-32 27 ± 17 149 i 6 4
