201120. lajstromszámú szabadalom • Kromatográfiás eljárás fermentációs lipopeptid termékek tisztítására
3 4 HU 201120 B A .fordított eljárás’ további előnye, hogy kevesebb elválasztási lépést igényel a nagyobb tisztaság és kinyerés mellett. Az LY146032 antibiotikum hajlamos a transzpeptidációs lebomlásra. Ha a lépések számét és a tisztításhoz szükséges időt csökkentjük, erősen lecsökken a transzpeptidécióva) keletkező melléktermékek megjelenésének lehetősége. A találmány szerinti eljárás kiindulhat a fermentációs terméket tartalmazó, szűrt megsavanyított vizes fermentléből vagy részlegesen tisztított fermentációs termék savas, vizes pufferben készült oldatából. Az eljárás a következő lépésekből áll: a) a fermentációs termék vizes oldatát a vizes közegben levő nem-funkcionális gyantával hozzuk össze; b) a megkötött terméket hordozó gyantáról a vizet fizikai eljárással eltávolítjuk; c) a megkötött terméket hordozó gyantát poláris szerves oldószerben vesszük fel; d) a gyantát poláris szerves oldószerrel mossuk, eltávolítva ezzel az UV-negatív szennyezéseket; e) az oldószer polaritását megnövelve eluáljuk a gyantáról a fermentációs terméket; és f) kinyerjük a fermentációs terméket. Amikor teljes fermentléből indulunk ki, a fermentlevet leszűrjük, a kémhatást beállítjuk pH=4,0-5,0, előnyösen pH=4,5 értékre, savanyításhoz vizes ecetsavat, sósavat, kénsavat, foszforsavat és hasonló savakat használva. Ha részlegesen tisztított fermentációs termékből indulunk ki, a terméket vizes pufferben oldjuk, melynek kémhatása pH=4,0-5,0, előnyösen pH=4,5. Alkalmas puffer például a nátrium-foszfát, ammónium-foszfát, ammónium-acetát, nátrium-acetát, stb., vizes oldata. Előnyös a nátrium-acetátból készült pufferoldat. A fermentációs terméket tartalmazó oldatot vizes közegben levő, funkciós csoportot nem tartalmazó gyantából készült oszlopon engedjük át. Az eljárásban használható, funkciós csoportot nem tartalmazó gyanták általában a sztirol és a divinil-benzol raakropórusos kopolimerjei. A nem-funkciós gyanták a gyanták ismert csoportját képezik. Ezekkel a gyantákkal, eredetükkel és tulajdonságaikkal foglalkozik a J.Chromatography 201:287-292 (1980) cikke. Tipikusan nem-funkciós gyanta a Diaion HP-20, Duolite ES-861, Amberlite XAD-16, Amberlite XAD-4, stb. Előnyösen nem-funkciós gyanta a Diaion HP-20. A gyantát eltávolítjuk az oszlopból, és a víz eltávolítására szűrjük vagy szárítjuk. A gyantát száríthatjuk vákuumszekrényben vagy levegőn, például egy Handy Dandy Filter—en (Sharpies Filter Co.). A fermentációs terméket hordozó gyantát azután poláris szerves oldószerben nedvesítjük. Ha a gyanta lényegében száraz, a nedvesítés történhet vagy a gyantának a szerves poláris oldószerhez történő adásával, vagy az oldószernek a gyantához való adásával. Ha észrevehető mennyiségű viz maradt a gyantában, a gyantát lassan kell hozzáadni a poláris szer- 5 vés oldószerhez, hogy elkerüljük a fermentációs termék leoldódását a gyantáról. A gyantát ezután oszlopba töltjük, és poláris szerves oldószerrel mossuk, hogy eltávolitsuk az UV-negatív szennyezéseket. A fermentációs 10 terméket az oldószer polaritásának megemelésével oldjuk le a gyantáról. A fenti eljárásban a .poláris szerves oldószer' metanolt, etanolt, acetont, n-propilalkoholt, izobutilalkoholt, n-butilalkoholt, metil- 15 -etil-ketont, acetonitrilt, tetrahidofuránt és hasonló oldószereket jelent, melyek kellően vízoldékonyak vagy elegyíthetók vízzel. Előnyös poláris szerves oldószer az acetonitril A poláris szerves oldószer 1-10%-os, elönyő- 20 sen 5%-os vizes savval savanyítható. Ehhez vizes ecetsavat, sósavat, kénsavat, foszforsavat, stb. használhatunk. A pH=4,0-5,0 értékre való savanyítás javítja az elválasztási folyamatokat, és ha a fermentációs termék az 25 LY146032, csökkenti a transzpeptidációs melléktermékek keletkezését. Az elúciós lépésnél az oldószer polaritásét egy polárisabb oldószer, például viz vagy metanol hozzáadásával növeljük. így 30 például a fermentációs termék elúciójét acetonitril/víz elegyével végezhetjük, ahol a komponens-arány 95:5 - 40:60, előnyösen 85:15 - 80:20. Az eluátumból a fermentációs terméket 35 ismert módon nyerjük ki, például kristályosítással, betöményitéssel, fagyasztva szárítással. Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizá- 40 rólag szemléltető célzatúak, a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. 1. példa 45 137,5 g nyers LY146032 antibiotikumot (24,4% tisztaságú) feloldunk 3,5 liter 1%-os nátrium-acetát pufferben, pH=4,5. Az oldatot 3 liter HP-20 gyantából (Diaion High Porous 50 Polymer HP-series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokió, Japán) készített oszlopon engedjük át. Az elfolyó oldatot eldobjuk. A gyantát 30 liter hideg ionmentes vízzel mossuk, a mosóvizet eldobjuk. 55 Az LY346032 antibiotikumot hordozó gyantát eltávolítjuk az oszlopból, és szűréssel eltávolítjuk a maradék vizet. A félig száraz gyantát lassan 32 liter acetonitrilhez adjuk. Az acetonitrilben felszuszpendált gyan- 60 tából ismét oszlopot készítünk. Az oszlopot 48 liter 95:5 arányú acetonitril/víz eleggyel mossuk, hogy eltávolitsuk az UV-negativ szennyeződéseket, például a szaporinokat, tripeptid flagmenseket. Az osz- 65 lopot 17 liter 85:15 arányú acetonitril/víz 4
