201120. lajstromszámú szabadalom • Kromatográfiás eljárás fermentációs lipopeptid termékek tisztítására
6 5 11U 201120 n eleggyel eluáljuk, egy literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót analitikai HPLC-vel követjük nyomon, és az LY146032 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az LY146032 antibiotikumot tartalmazó egyesített frakciót ötszörös térfogatú hideg ionmentes vízzel hígítjuk és 500 ml HP-20 gyantából készült oszlopon engedjük át. Az oszlopot 500 ml ionmentes vízzel mossuk, hogy eltávolítsuk a sókat. A gyantát 00:40 arányú acetonitril/víz eleggyel eluáljuk. A HPLC szerint LY146032 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesitjük, betöményitjük és fagyasztva szárítjuk, 53,3 g 89,3% tisztaságú LY146032 antibiotikumot nyerve (kitermelés: 60%-os). UV: Xmax 220 nm, E 46500; 260 nm, £ 10000. 2. példa 1914,2 g LY146032 (24,4% tisztaságú) antibiotikumot tartalmazó 157 liter nyers koncentrátumot 600 liter hideg tisztított vízzel hígítjuk. 60 liter HP-20 gyantát adunk a hígított nyers koncentrátumhoz. Az oldat kémhatását jégecettel pH=4,7 értékre állítjuk be, a habzás gátlására hozzáadunk 6 liter n-butilalkoholt, és a szuszpenziót 20 órán ót kevertetjük. A gyantát 300 liter vizzel mossuk. Az antibiotikumot hordozó gyantát Handy Dandy Filterbe tesszük, és légáramban szárítjuk. A száraz gyantát 600 liter acetonitrilhez adjuk, és oszlopba töltjük. Az oszlopot 60 liter acetonitrillel mossuk. A gyantát acetonitril/metanol/0,25%-os foszforsav, 80:15:5 arányú elegyével mosva, eltávolítjuk az UV-negativ szennyezéseket. Az oszlopot 120 liter 80:20 arányú acetonitril/viz eleggyel eluáljuk. 25 literes frakciókat gyűjtve az LY146032 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesitjük. Az egyesített frakciókat betöményitjük és fagyasztva szárítjuk, 993,1 g 50,5%-os tisztaságú LY146032 antibiotikumhoz jutva (51,9%-os kinyerés). UV: X.O, 220 nm, £ 46500; 260 nm, £ 10000. 3. példa 22,76 mg echinokandin B-t tartalmazó 200 ml teljes fermentlevet 400 ml metanollal hígítunk. Az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítjuk. A szűrlet kémhatását 5n sósavval pH=5,0 értékre állítjuk be, és 10 ml HP-20 gyantához adjuk. A szuszpenziót azonos térfogatnyi vízzel hígítjuk, és 60 percen keresztül kevertetjük, hogy az echinokandin B rákötődjön a gyantára. A gyantát szűréssel elválasztjuk, és 25 °C hőmérsékletű vákuumszekrényben szárítjuk 16 órán át. A száraz gyantához acetonitrilt adunk és oszlopot készítünk. A gyantát három oszloptérfogatnyi 5 acetonitrillel mossuk. Elúcióhoz három oszloptérfogatnyi 90:10 arányú acetonitril/víz elegyet használunk. 26%-os kinyeréssel jutunk az összehasonlító mintával azonos tisztaságú anyaghoz. Tovább eluálva az oszlopot három 10 oszloptérfogatnyi 80:20 arányú acetonitril/víz eleggyel további 38%-os kinyeréssel olyan terméket kapunk, mely a referens mintához viszonyítva 41,2%-os tisztaságú. UV: Xmax 225 nm, £ 18000, 275 nm, £ 3000; 15 284 nm, váll, £ 2500. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 20 1. Eljárás fermentációs lipopetid termékek vizes oldatának tisztítására, melynek során az oldatot vizes közegben levő, funkciós csoportot nem tartalmazó gyantával hozzuk össze, azzal jellemezve, hogy az terméket 25 hordozó gyantáról a vizet fizikai eljárással eltávolítjuk, a terméket hordozó gyantát poláris szerves oldószerben nedvesítjük, a gyantát poláris szerves oldószerrel mossuk, az oldószer polaritását növelve eluáljuk a 30 terméket a gyantáról, majd kinyerjük a lipopeptidet. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az LY146032 antibiotikum, mint fermentációs ter-35 mékeknek a tisztítására, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagot az ismertetett módon feldolgozzuk. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 40 echinokandin B-nek, mint fermentációs terméknek a tisztítására, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagot az ismertetett módon feldolgozzuk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 03.) 45 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HP-20 gyantát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10.) 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poláris szerves oldószerként 50 acetonitrilt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10.) 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptidet a funkciós csoportot nem tartalmazó gyantáról 5-60% vi-55 zet tartalmazó acetonitrillel eluáljuk. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10.) 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptidet a funkciós csoportot nem tartalmazó gyantáról 10-20% 60 vizet tartalmazó acetonitrillel eluáljuk. (Elsőbbsége: 1987. 06. 10) Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R-4962 - KJK 90.3348.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató 5
