201120. lajstromszámú szabadalom • Kromatográfiás eljárás fermentációs lipopeptid termékek tisztítására
1 HU 201120 » 2 A találmány tárgya kromatográfiás eljárás fermentációs lipopeptid termékek, előnyösen az LY146032 antibiotikum fermentléböl történő tisztítására funkcionális csoportot nem tartalmazó gyanta .fordított eljárásban" való al- 5 kalmazásával. A találmány szerinti eljárásban a vegyületet vizes fázisban megkötjük a gyantán, a vizet fizikai módon eltávolítjuk a gyantáról, majd a gyantát poláris szerves oldószer- 10 rel nedvesítve, végrehajtjuk az elválasztást. Az eljárás olyan vegyületek tisztítására alkalmas, melyek adszorbeálódnak a funkciós csoportot nem tartalmazó gyantákon. Az (I) általános képletü LY146032 anti- 15 biotikum az A21978C antibiotikumok közül az N-dekanoil-származék, és A21978Co faktorként azonosított. Az A21978C antibiotikumokat a 4 208 403 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leirt fermentációs eljárásokkal 20 állítjuk elő. Az LY146032 antibiotikum és ennek tisztítási eljárásai a 4 537 717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban lettek leírva. E szerint az eljárás szerint az A21978C antibiotikumot fermentációs eljárás- 25 sál állitják elő, majd enzimatikus úton eltávolítják a zsírsav oldalláncot, megkapva az A 21978C alapvázát. Az alapvázat egy kívánt acilcsoporttal, például n-dekanoilcsoporttal újra acilezik, hozzájutva igy az A21978 cikli- 30 kus peptidhez, amint azt a 4 527 717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírja. Ezeknek a ciklikus peptideknek egy javított tisztítási eljárását írják le Floyd 35 M.Huber, Richard L. Pieper és Anthony J. Tietz a 0178152 számú európai nyilvánosságra hozatali iratban. Az LY146032 és gyógyászati szempontból hasznos egyéb fermetációs termékek érdé- 40 kessége és jelentősége miatt e vegyületek fermentációs keverékből történő tisztítására folyamatosan történik az újabb és hatékonyabb eljárások kidolgozása. A jelen eljárás különböző lipopeptid 45 fermentációs termékek elválasztására és tisztítására alkalmas, ide értve az LY146032 antibiotikumot is. A tisztítási eljárás kiindulhat a fermentléböl vagy egy részlegesen tisztított feldolgozás közti állapot! >ól is. Az eljárás ab- 50 ból áll, hogy az antibiotikumot vizes közegben funkcionális csoportot nem tartalmazó gyantán adszorbeáltatjuk, a vizet ezután fizikailag eltávolítjuk a gyantáról, a gyantát poláris szerves oldószerben felvesszük és az 55 oldószer polaritását növelve, eluáljuk a terméket a gyantáról. Az eddigi eljárásokban az LY146032 részleges tisztítása úgy történik, hogy a teljes fermentlevet leszűrik, és a szürletet egy 60 HP-20 gyantaoszlopon (Diaion High Polymer MH-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokió, Japán) engedik át. Az oszlopot vízzel és 90:10 - 80:20 arányú víz/acetonitril eleggyel mossák, az LY146032 65 antibiotikumot 60:40 arányú víz/acetonitril eleggyel eluálják. Az elúciót papírkromatográfiával vagy ultraibolya detektálással követik nyomon. Az LY 146032 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítik, csökkentett nyomáson bepárolják és fagyasztva szárítják. Ez az eljárás féltiszta LY140632 antibiotikumot eredményez, melyet acetonitril/metanol/nátrium-acetát pufferben oldanak, és nem-funkcionális HP-20ss makroretikuláris oszlopon engedik át. Ugyanezzel az oldószer-rendszerrel eluálnak és az LY146032 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítik, vízzel hígítják és HP-20 gyantaoszlopra viszik. Az oszlopot vízzel mossák, hogy eltávolítsák a sókat, acetonitril/víz 60:40 arányú elegyével eluálnak, és az LY146032 frakciókat összegyűjtik. Ezeket a lépéseket addig ismétlik, amíg kellő tisztaságú termékhez nem jutnak. Az LY146032 antibiotikumnak a hasonló szerkezetű vegyületektől való elválasztását és tisztítását akadályozzák azok a fermentlében levő szennyezések, melyek ultraibolya fényben nem mutathatók ki. Elsősorban a szaponinok és más alkotórészek ilyen .UV-negativ" szennyezések. Ezeknek a vegyieteknek az oldékonysági jellemzőik hasonlóak az LY 146032 jellemzőihez, ezért nehéz tőlük megszabadulni. Ezeknek a vegyületeknek a jelenléte a betöményítéskor habzást okoz, és a kromatográfiás lépéseknél csökkenti az elválaszthatóságot. Az említett szennyezések eltávolítására különféle kromatográfiás módszerekkel próbálkoztak, ideértve a szilikagél C-18 adszorbensen (Quantum LP-1) végzett fordított fázisú kromatografálást, a szilikagélen végzett normál fázisú kromatografálást és az ioncserés kromatografálást. Ezek az eljárások lényegesen nem növelték az LY146032 antibiotikum tisztaságát ahhoz a termékhez képest, amelyet a fent ismertetett módon a HP-20 oszlopon kaptak. Mindezeket a módszereket az alacsony kapacitás, a gyenge elválasztási képesség és az LY146032 alacsony kinyerési aránya jellemzi. Hogy ezeket a hiányosságokat kiküszöböljük, egy új elválasztási módszert dolgoztunk ki. Felismertük, hogy mind a termék tisztasága, mind a kinyerése szempontjából lényeges javulást érünk el, ha a HP-20 gyantán végzett fent leírt első lépést .fordított eljárásban" végezzük. A .fordított eljárásban" a funkciós csoportot nem tartalmazó gyantán történő adszorpciót vizes-polárisfázisban végezzük, az elválasztást pedig szerves -poláris- fázisban. A .fordított eljárás" alkalmazásával az LY146032 tisztaságát sikerült kétszeresére növelni, és minthogy sikerült eltávolítani a későbbi tisztítási lépéseket zavaró szennyezéseket, a végső termék tisztasága 80%-ról 93%-ra javult, ugynakkor az összkinyerés 5%-ról 35%-ra emelkedett. 3
