201119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kedarcidin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 201119 B 10 téshez mechanikus keverólapátokat használhatunk. Ha szükséges alkalmazhatunk habzésgátlókat is, például disznózsír-olajat vagy szilikonolajat. A kedarcidin antibiotikum termelődése a fermentáció alatt könnyen nyomonkövethetó az antibiotikus hatás felhasználásával - vizsgálati mikroorganizmusként Bacillus subtilist használva - vagy a hatóanyag citotoxicitását kihasználva, a vizsgálatokhoz egér vagy patkány (B16-F10) vagy humán (például HCT-116, KB) tumorsejteket alkalmazva. Nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi köre nem korlátozódik a fent leirt és különösen előnyös L-585-6 törzs alkalmazására. Az oltalmi kör felöleli a nevezett mikroorganizmus más, kedarcidint termelő variánsainak és mutánsainak alkalmazását is, mely mutánsok és variánsok a szokásos módon - Röntgen besugárzással, ultraibolyafény besugárzással, nitrogén-mustárokkal, fágfertózéssel, stb. - előállíthatok. Az antibiotikum kinyerése és tisztítása: A találmány szerinti tumorellenes protein a fehérjekinyerésnél általánosan alkalmazható eljárásokkal nyerhető ki a fermentléból, nevezetesen dialízissel, ultraszűréssel, gélszűréssel, izoelektromos lecsapással, kisózással, elektroforézissel, ioncserés kromatográfiával és affinitás kromatográfiával. Az említett módszerek kombinálva is alkalmazhatók a fehérjék tisztításánál. A kinyerés és a tisztítás az egyes lépéseknél nyomonkövethetó, például mikrobiológiai úton B. subtilis vizsgálati mikroorganizmussal, in vitro az egér, patkány vagy humán ráksejtekkel szembeni citotoxikus hatás alapján, tumorellenes hatáson alapuló in vivo vizsgálatokkal vagy fizikai módszerekkel, mint amilyenek az UV és HPLC vizsgálatok. Az 1. ábrán egy tipikus elválasztási és tisztítási eljárás lépéseit mutatjuk be. A bemutatott folyamat természetesen csak szemléltető célzatú, a szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy más módszerek alkalmazásával is eljuthatunk nagytisztaságú, biológiailag aktiv proteinhez. A fermentléból először például centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk a szilárd anyagot. Amennyiben szűrést alkalmazunk, előnyös szűrési segédanyagot, például Dicalite-ot használni. A szűrletet ezután anioncseréló kromatográfiának vetjük alá, eluensként először pH = 7-8 kémhatású kationpuffert használva, arait ugyanebben a pufferben készített nátrium-klorid oldat követ. Az említett pH tartományban használható kationpuffer lehet például a trisz-HCl. A nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel kapott frakciókat összegyűjtjük, betöményítjük és tovább tisztítjuk gélszűréses kromatográfiával ugyanazt a kationpuffert használva. A frakciókat összegyűjtjük és megvizsgáljuk bennük az aktív anyag jelenlétét. Az eluátum kezdeti kiértékelésére alkalmas a Bacillus subtilis-szel szembeni aktivitáson alapuló vizsgálati módszer. A gátlási zónát adó frakciókat egyesítjük, betöményítjük és anioncseréló kromatográfiával tisztítjuk tovább, melyhez kiindulási eluensként pH = 7-8 kémhatású kationpuffert használunk, melynek lineárisan növeljük az ionerósségét. Az aktiv frakciókat nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélen (SDS-PAGE) végzett elektroforézissel, izoelektromos fókuszálással és HPLC módszerrel vizsgáljuk. Az egységesnek bizonyuló frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítva aktív fehér jeprepaxátumhoz jutunk. Az antibiotikum jellemzése: A kedarcidin aktív, tumorellenes, proteintípusú antibiotikum, mely egyetlen polipeptidláncból és egy nem-protein kromofor alkotórészből áll. Noha az SDS-PAGE, izoelektromos fókuszálás és HPLC vizsgálatok szerint az antibiotikum minta homogénnek bizonyult, a szekvencia vizsgálatok alatt kiderült, hogy az antibiotikum egy főkomponensból és egy vagy két mellékkomponensból áll. Az eltérés az egyes variánsok között a kezdeti, N-terminális aminosavban van, amint azt az alábbiakban ismertetjük. A tumorellenes aktivitás szempontjából nem szükséges, hogy az egyes komponenseket elválasszuk egymástól. Az antibiotikum aminosav-összetételét az ismert módszerek valamelyikével állapítjuk meg. A tisztított protein aminosav-összetételét a IV. táblázatban foglaltuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
