201119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kedarcidin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

11

HU 201119 B

12

IV. Táblázat

A kedavcidin aminosavósszetétele

mmól

mól%

(a)

aminosav

(b)

asp

2,765

8,1

10,1

9,3

(6)

asn

(3)

thr

3,18

9,3

11,6

10,6

(11)

ser

3,163

9,3

11,5

10,6

(12)

glu

1,982

5,7

7,0

6,5

(4)

gin

(2)

pro

1,615

4,7

5,9

5,4

(4)

gly

5,529

16,2

20,1

18,5

(18)

ala

5,566

16,3

20,3

18,6

(18)

val

3,731

11

13,6

12,5

(13)

met

0,2873

0,8

1,1

1,0

(1)

ile

0,8531

2,5

3,1

2,9

(3)

leu

1,298

3,8

4,7

4,3

(4)

tyr

0,6274

1,8

2,3

2,1

(2)

phe

1,565

4,6

5,7

5,2

(5)

his

0,6235

1,8

2,3

2,1

(1)

lys

0,3196

0,9

1,2

1,1

(0)

arg

1,001

2,9

3,7

3,3

(3)

cys

0

0

0

0

(4)

trp

0

0

0

0

(0)

(a) Aminosav száma peptidmolekulánként, feltéve, hogy a peptid molekulatömege 12.000.

(b) Az aminosavak száma, feltéve, hogy a teljes peptid 114 aminosavból áll. A zá- 35 rójelben lévő értéket az aminosav-sorrend analízise során nyertük.

A kedarcidin terminális aminosavsorrendjének megállapításához az antibiotikumot 40 2-merkapto-etanollal redukáljuk, 15% akrilamidot alkalmazó SDS-PAGE módszerrel tovább tisztítjuk és a gélről elektroelúcióval vagy más elektrokémiai módszerrel nyerjük ki a proteint. 45

A legtöbb enzimatikus hasításhoz további tisztítás nélkül használjuk a kedarcidint.

A kedarcidint 100 pl 0,4 M trisz-HCl pufferben, pH = 8,5 redukáljuk 20 mM ditiotreitollal 2 órán ót 50 °C hőmérsékleten. A puffer 6M ,50 guanidin.HCl-ot és 0,1% Na2EDTA-t tartalmaz.

Ezt követően 100 mmól 4-vinil-piridinnel S-piridil-etilálunk szobahőmérsékleten, egy éjszakán át. 5%-os (térf.) ecetsavban végzett 24 órás dialízissel eltávolítjuk a reagenseket, 55 és a módosított kedarcidint egy Speedvac centrifuga-koncentrátorban (Savat Instruments) szárítjuk.

Az S-piridil-etilált kedarcidint ASP-N enzimmel vagy a S. aureus V8 proteázzal en- 60 zimatikusan hasítjuk. Az enzimatikus reakciót 40 pl 0,7 M karbamidot tartalmazó 0,1 M trisz ecetsav pufferben, pH = 8,0 végezzük 37 °C hőmérsékleten, egy éjszakán át. Az enzim/szubsztrát arány ASP-N esetében 1:100, V8 65

proteáz esetében 1:10. A tripszines emésztést 40 pl 0,1 M trisz-ecetsav pufferben, pH = = 8,0 végezzük 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. Az enzim/Bzubsztrát arány 1:20. Az enzimes emésztményt trifluor-ecetsavval pH = 2,0 kémhatásra savanyítjuk és fordított fázisú HPLC-vel szétválasztjuk.

A fordított fázisú HPLC tisztítást egy Model 130A készülékrendszeren végezzük (Applied Biosystems, Inc.) 40 °C hőmérsékleten RP-300 oszlopot (2,1 x 100 mm, Applied Biosystem, Inc.) használva. Eluáláshoz acetonitril grádíenst használunk, a kezdő puffer 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav oldat, a befejeződő 60% acetonitrilt tartalmazó 0,085%-os trifluor-ecetsavas puffer. A pepiidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Az aminosav sorrendet automata aminosavsorrend-analizátorral határozzuk meg (Model 475A, Applied Biosystems, Inc.) a szokásos eljárással.

A főkomponens polipeptid 114 aminosavból áll. Az aminosavak meghatározott sorrendje a következő:

N-terminélis

H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-alaile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asnval-ala-gluphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thrser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-8