201118. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amfotericin B kristályok előállítására fermentációs közegben
1 HU 201118 B 2 A jelen találmány tárgya amfotericin B magas kitermeléssel való előállítására adaptált fermentációs eljárás, pontosabban amfotericin B kristályoknak közvetlenül a fermentleben való előállítására szolgáló eljárás. 5 Az amfotericin B a Stereptomyces nodosus által termelt, laktongyűrűbe zárt hosszú polién-láncot tartalmazó gombaölö hatású antibiotikum. Pontos szerkezetét, amely a polién-láncot tartalmazó gyűrűn lévő egyik hid- 10 roxilcsoporthoz glikozidosan kapcsolódó aminocukrot is tartalmaz, csak az 1970-es évek elején, feltalálását követően 15-20 évvel tisztázták [Mechlinski és mtsai. Tetrahedron Letters 1970, 3873; Borowski és mtsai., u. ott 15 3909; R.C.Pandey and K.L.Rinehart, J. Antibiot., 29, 1035 (1976)]. Részletes leírására vonatkozólag utalunk I.M.Asher és mtsai. összefoglalójára a K.Florey szerkesztésével készült Analytical Profiles of Drug Substances (Aca- 20 demic Press, New York, 1977) 6. kötetének 1- -42. oldalain. A tiszta amfotericin B 170 °C-ig stabil. Vízben gyakorlatilag nem oldódik, savas (pH 2) vagy lúgos (pH 11) vizes oldata is 25 csak körülbelül 0,01 tömegX-os. Az általában igen jó oldószernek tekinthető dimetil-formamid és dimetil-szulfoxid is csak 0,5-1 tömeg%-os oldat készítésére alkalmas. Az amfotericin B-t terápiásán szisztéma- 30 tikus mikózisok kezelésére használják. Mostanáig amfotericin B kristályokat fermentléból körülményes kinyerési eljárásokkal állítottuk elő, ami költséges szűrést, oldószeres extrakciót és kristályosítási müve- 35 leteket jelentett. A jelen találány szerint az amfotericin B kristályosodását közvetlenül a fermentiében idézzük elő, amely valamilyen vízoldható vagy vízben oldhatatlan fermentációs tápta- 40 laj, amilyen például a 2,908.611. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt, és amely fermentációs táptalaj valamilyen nitrogénforrást, valamilyen szén-/energiaforrást és adott esetben a folyamat szabá- 45 lyozására szolgáló egy vagy több szervetlen sót tartalmaz. A jelen találmány továbbá amfotericin B kristályok közvetlenül fermentiében való képzésére egy olyan eljárást biztosit, amely 50 eljárásnak része az előbb leírtak szerinti fermentációs táptalaj, Streptomyces nodosus ilyen fermentációs táptalajban történő tenyésztése és az amfotericin B kristályosodásának és kívánt eseben a mikrobiális sejt 55 autolizisének előidézése. A kristályosítás és autolizis a fermentlé megfelelő, legalább 50 °C-on és előnyösen 70 °C-tól 130 °C-ig terjedő hőmérsékleten megfelelő időtartamig, vagyis 1 perctől körülbelül 10 óráig és elő- 60 nyösen 10-tól 45 percig tartó melegítésével végezhető amfotericin B kristályok képződésének előidézése céljából. A kristályosodás úgy is beindítható, hogy a fermentáció során amfotericin B kris- G5 tályokkal oltjuk be a fermentlevet, előnyösen a fermentáció kezdete után körülbelül 10-40 órával. Autolizis végrehajtható enzimek, például lizozitn vagy más olyan hasonló enzimek segítségével is, amelyek oldó hatásúak a sejtfalra. Amennyiben valamilyen enzimet vagy beoltást alkalmazunk, enyhébb hőkezelésre van szükség. A jelen eljárásban használt fermentáció táptalajok körülbelül 0,1-től körülbelül 20, előnyösen körülbelül 0,5-től körülbelül 5 tömeg%-ig terjedő mennyiségű nitrogénforrást tartalmaznak. Megfelelő nitrogénforrásokra példaként kazeinhidrolizátum, gyapotmag vagy származékai, kukoricalekvár, szójaliszt vagy valamilyen más hasonló szerves vagy szervetlen nítrogénforrás vagy ezek oldható származékai említhetők. A szénhidrát-forrás körülbelül 0,5-tól körülbelül 20, előnyösen körülbelül 0,5-tól körülbelül 10 tömeg%-ig terjedő mennyiségben van jelen a fermentációs táptalajban. Megfelelő szénhidrát-forrásokra példaként keményítő, dextrin, cukrok, így maltóz, laktóz és glükóz, glicerin és hasonlók említhetők. A találmány szerinti eljárásban használt fermentációs táptalajok adott esetben más hagyományos fermentációs táptalaj komponenseket, például egy vagy több szervetlen sót is tartalmazhatnak, amelyek a folyamat szabályozását segítik. Ilyen szervetlen sókra az oltalmi kört semmiképp sem korlátozó példaként kalcium-karbonát, kálium-dihidrogén-foszfát, ammónium-szulfát, magnézium-szulfát, mangán-szulfát vagy dinátrium-hidrogén-foszfát említhető. A fermentációs táptalaj tartalmazhat egy vagy több habzásgátló szert is, például szilikon habzásgátlót. Egy előnyös összetételű fermentációs táptalaj körülbelül 1-től körülbelül 6 tömegX-ig terjedő mennyiségű szerves nitrogénforrást, előnyösen szójalisztet, körülbelül 2-tól körülbelül 10 tömeg%-ig terjedő mennyiségű glükózt, mint szénhidrátforrást, adott esetben körülbelül 0,01 tömeg%-tól körülbelül 0,2 tömeg%-ig terjedő mennyiségű egy - vagy többfajta szervetlen sót, előnyösen kalcium-karbonátot és kálium-dihidrogén-foszfátot és adott esetben körülbelül 0,05 tömegX-tól körülbelül 2 tömeg%-ig terjedő mennyiségű szilikon habzásgátlót tartalmaz. A fermentációs termék (amfotericin B) elkülöníthető kristályainak a fermentiében való képzésére szolgáló jelen találmány szerinti módszer egy előnyös megvalósitási formájában a fermentációs táptalaj lehet tökéletesen vizoldható. A fermentációs táptalajt az amfotericin fermentációnál a 2,908.611. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt eljárás szerint használjuk fel. 3
