201118. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amfotericin B kristályok előállítására fermentációs közegben

3

HU 201118 B

4

A kész fermentlevet utána legalább 50 °C hőmérsékleten megfelelő ideig, például 10 - 15 percig melegítjük a mikrobiális sejt autolízis kiváltása céljából, ami az amfotericin B kristályok képződését eredményezi. Egy másik megvalósítási formában lizomzimot vagy más proteolitikus enzimet (például proteázokat, glukanázt, papaint, tripszint vagy pepszint) adunk a fermentléhez feldolgozáskor 5 - 7,5 pH-tartományban, és körülbelül

20 °C-tól 80 °C-ig terjedő hőmérsékleten körülbelül 30 perctől körülbelül 5 óráig terjedő időtartamig inkubáljuk. Utána a hőmérsékletet a kristályképzödés tökéletessé tételére 30 percig 90 °C-ra vagy magasabbra emeljük.

A kristályosodás előidézésére szolgáló másik előnyös eljárásban a fermentáció során (a fermentlé térfogatára számítva) körülbelül 0,01-től körülbelül 0,1 tömeg/térfogat%-ig terjedő mennyiségű steril amfotericin B kristályt juttatunk be a fel-mentorba a fermentálás 10 - 40. órájában; utána a fermentációt az előbb leírtak szerint folytatjuk (az előbb az autolizis műveletre leirt) melegítéssel vagy melegítés nélkül. A fermentáció végén amfotericin B mikrokristályok vannak jelen a fermentlében, amely kristályok elkülöníthetők. A beoltási eljárás mellett előnyös a melegítés alkalmazása is.

Az amfotericin kristályok könnyen elkülöníthetők a fermentléból bármilyen szilárd/folyadék elválasztási művelettel, beleértve flotációs technikát is.

A következő példák a jelen találmány előnyösen megvalósításait szemléltetik.

1. példa

Amfotericin B kristályokat az alábbiakban leírtak szerint állítunk elő.

Egy 20 literes adag Steptomyces nodosus ATCC 14899-et fermentálunk amfotericin B termelésére az alább megadott inokulum-képzés és fermentációs feltételek mellett:

Inokulum-képzés:

A. Első szakasz.

Inokulum-forrás: fiolában lefagyasztott

Streptomyces

nodosus ATCC 14899 tenyészet.

Táptalaj:

Glükóz

1%

N-Z Amin B

1,5%

Élesztőkivonat

1,0%

Nátrium-klorid

0,5%

Kalcium-karbonát

0,1%

pH 6,8 - 7,0-re állítva.

Térfogat: 100 ml 500 ml-es lombikban. Sterilizálás: 30 perc 121 °C-on. Hőmérséklet: 25 °C.

Inkubálás: 48 óra oda-vissza lengő rázógépen 220 ford/perc-nél. B. Második szakasz.

Inokulum-forrás: 10% az első szakaszból.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Táptalaj: ugyanaz, mint az első szakaszban.

Sterilizálás: 30 perc 121 °C-on.

Térfogat: 100 ml 500 ml-es palackban. Hőmérséklet: 25 °C.

Inkubálás: 48 óra oda-vissza lengő

rázógépen 220 ford/percnél.

Szaporítás:

Táptalaj:

Élelmezési szójaliszt (Nutrisoy Flour) 5,0%

Kukoricalekvár 1,6%

Nátrium-klorid 0,5%

Szilikon habzásgátló 0,1%

Sterilizálás: 40 perc 121 °C-on. Hőmérséklet: 28 °C.

Keverés: 1,4 Kur/m3.

Levegőztetés: 1 térf./térf. x perc. Szaporítási ciklus: 28 óra.

Inokulum méret: 100 ml a második lombikos szakaszból,

500 ml-es lombikban.

Fermentációs körülmények:

Táptalaj:

Glükóz

7,0%

Szójaolaj liszt

2,5%

Kalcium-karbonát

0,9%

Kálium-dihidrogén-foszfát

0,01%

Szilikon habzásgátló

0,02%

Sterilizálás: 45 perc 121 °C-on.

Hőmérséklet: 25 °C.

Keverés: 7 Kur/m3.

Levegőztetés: 1 térf./térf. x perc.

Fermentációs ciklus: 136 óra.

Inokulum méret: 14% a szaporítási szakaszból.

A kapott kész fermentlé 2050 jug/ml amfotericin B-t és 390 (ug/ml amfotericin A-t tartalmaz.

A fermentlé mikroszkópos vizsgálata nem mutat ki kristályokat a fermentlében. A fermentlevet 60 °C-on 15 percig melegítjük. Mikroszkópos vizsgálat után a fermentlében bőségesen találunk amfotericin kristályokat, amelyek könnyen elkülöníthetők a fermentléböl flotációval vagy más nem költséges elválasztási művelettel.

50

2. Példa

Amfotericin por kinyerése fermentléból.

55 A példa fermentációs részletei azonosak

az 1. példáéval kivéve, hogy a fermentlevet a fel nem használt szójabab maradékok eltávolítására pamutszövettel bélelt Sparkler-szűrón megszűrjük. A kapott szürletet 60 utána ismét sterilizáljuk, és fermentációs táptalajként felhasználjuk. A kapott kész fermentlé 960 pg/ml amfotericin B-t tartalmaz 112 óra fermentálás után. A fermentlét azután néhány percig 120 °C-on kezeljük az 65 amfotericin kristály-képződés beindítása cél-4