201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
HU 201115 B 16 megfelelő Sephadex® oszlopon vagy hasonlókkal. Az előtisztított termék végső tisztítását például affinitáskromatográfiával végezzük, antitest affinitáskromatográfiával, főleg monoklonális antitest affinitáskromatográfiával, a szakterületen ismert módszerekkel oldhatatlan hordozóhoz kötött monoklonális anti-TPA antitestekkel. A TPA-nak tenyészléböl való izolálására további előnyös módszer a TPA szelektív adszorpciója specifikus affinitásé hordozóra, mely vagy oldhatatlan alapra, például dextránra [például (15)] kovalensen kötött oldható fibrilláris fragmentekböl áll, vagy főleg Sepharose oszlopra kötött DE-3-ból. A DE-3 tripszin inhibitor, mely az Erythrina latissima (16) magjaiban található. Úgy találták, hogy a DE-3 képes a TPA aktivitását is gátolni. így a tisztitott DE-3 inhibitort oldhatatlan hordozóhoz, például BrCN-nal aktivált Sepharos^Ö-hoz lehet kapcsolni ismert módszerekkel. A TPA adszorbeálódik az inhibitor hordozóra, és kaotróp anyagot tartalmazó pufferral oldható le. A jelen találmány egy előnyös kiviteli formájában a tenyészlevet, miután szükség esetén a fent említett tisztítási lépések közül eggyen vagy többön átment, szobahőmérsékleten olyan BrCN-nal aktivált Sepharos^© oszlopon bocsátjuk keresztül, melyhez a DE-3 inhibitor van kapcsolva. Miután átmostuk az oszlopot, az adszorbeáit szöveti plazminogén aktivátort eluáljuk, az oszlopot pufferoldattal, például olyan foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, melynek pll-ja körülbelül 5,5- -6,0 és kaotróp anyagot, például KSCN-t tartalmaz körülbelül 1,4-2,0 mól, előnyösen 1,6 mól koncentrációban. Más módszer szerint benzamidint vagy arginint használhatunk leszorító anyagként. Előnyösen egy felületaktív anyagot, főleg nem-ionos detergenst, úgymint Triton X-10Ö®-t vagy Tween 8C®-t adunk az összes, a tisztítási lépésekben alkalmazott pufferoldatokhoz, hogy megakadályozzuk a szöveti plazminogén aktivátornak az edény falára való adszorpcióját, és megnöveljük stabilitását. A detergenst 0,01-0,1% végkoncentrációban alkalmazhatjuk. Abban az estben, ha a szöveti plazminogén aktivétor kiválasztódik az élesztősejt periplazmatikus terébe, egyszerűsített módszert alkalmazhatunk. A fehérjét a sejt feltárása nélkül nyerhetjük ki, a sejtfalat enzimatikusan eltávolítva vagy olyan kémiai anyagokkal, például tiol reagensekkel vagy EDTA-val kezelve, melyek megrongálják a sejtfalat és lehetővé teszik, hogy a keletkezett TPA kiszabaduljon. Abban az esetben, ha a TPA a tenyészlébe választódik ki, közvetlenül onnan nyerhetjük ki. Kromoszómálisan integrálódott TPA gént tartalmazó élesztósejtek tenyésztését, valamint a keletkezett TPA izolálását és tisztítását a fentiekkel azonos módon végezzük. 15 Olyan TPA előállítása céljából, amely lényegében nem tartalmaz pro-TPA-t, a pro-TPA-t enzimatikusan TPA-vá alakítjuk, például plazminnal, vagy a pro-TPA-ra azonos hatással rendelkező enzimmel. Olyan pro-TPA előállítása céljából, mely lényegében nem tartalmaz TPA-t, a tisztítási eljárás során végig előnyösen proteáz inhibitort, úgymint aprotinint (Trasylo® vagy bázikus pankreatikus tripszin inhibitort használunk, hogy gátoljuk az esetleg nyomokban jelenlévő proteázokat, melyek a pro-TPA-nak részleges TPA-vá alakulását okozhatják. A végső tisztítást olyan oszlopon kromatografálva végezzük, mely szelektív affinitású reagenst, például DE-3-at tartalmaz, olyan inhibitor jelenlétében, mely szelektíven csak a TPA-t köti, a pro-TPA-t nem, ilyen pélául a diizopropil-fluor-foszfát (DFP) vagy a nitrofenil-guanidinobenzoát. Ezek a reagensek megakadályozzák, hogy a TPA az affinitásoszlopra adszorbeálódjon. Ennek következtében a TPA keresztülfolyik a DE-3 oszlopon, mig a pro-TPA adszorbeálódik az oszlopra, és a fentiek szerint leoldható onnan. A glikozilezett és glikozilezetlen fehérjék keverékét például konkanavalin-A Sepharose® oszlopon kromatografálva választhatjuk szét. A glikozilezetlen féhérjék átfolynak az oszlopon, míg a glikozilezett fehérjék szelektíven adszorbeálódnak és ismert módszerekkel, például kaotróp anyaggal (KSCN) kombonált aifa-metil-mannoziddal eluálhatók. A glikozil-csoportokat enzimatikus módszerekkel, például endoglikozidéz I(-val is eltávolíthatjuk. Ezzel a módszerrel lehetséges a glikozilezetlen termék előállítása tiszta formában. A jelen találmány szerint előállított TPA-k és pro-TPA-k értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek. így ezeket a fehérjéket az ismert plazminogén aktivátorokkal azonos módon használhatjuk emberek kezelésére, trombózis vagy más olyan állapot megelőzésére vagy kezelésére, ahol a plazminogén aktiválás mechanizmusa útján létrejövő helyi fibrinolitikus vagy proteolitikus aktivitásra van szükség, például arterioszklerózis, miokardiális és cerebrális infarktus értrombózis, trombo-embólia, operáció utáni trombózis, tromboflebitisz és diabetikus vaszkulopátia esetén. A találmány vonatkozik továbbá élesztö-specifikusan glikozilezett TPA-ra és pro-TPA-ra valamint ezek keverékére, pontosabban a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztőre, főleg a Saccharomyces cerevisiae-re specifikus glikozilezésre. A találmány tárgya továbbá a TPA, pro-TPA, ezek keveréke, ha a jelen találmány szerinti eljárással állítjuk elő. A találmány vonatkozik továbbá a feltalált eljárással előállított TPA-ra, pro-TPA-ra és ezek keverékére. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
