201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
17 18 HU 201115 B A találmány fő tárgyai a hibrid-vektorok, a transzformált élesztő törzsek, az előállítási eljárásuk, valamint a TPA, pro-TPA vagy keverékük előállításának módja, amint azt a példákban ismertetjük. 5 Gyógyászati készítmények A jelen találmány szerint előállítható új 10 fehérjék, főleg a TPA és pro-TPA értékes gyógyászati tulajdonságokkal rendelkeznek, így a TPA-t és pro-TPA-t az ismert plazminogén aktivátorokkal azonos módon használhatjuk emberek kezelésére, trombózis vagy 15 más olyan állapot megelőzésére vagy kezelésére, ahol a plazminogén aktiválás mechanizmusa útján létrejövő helyi fibrinolitikus vagy proteolitikus aktivitásra van szükség, például arterioszklerózis, miokardiális és ce- 20 rebrális infarktus, értrorabózis, tromba-embólia, operáció utáni trombózis, tromboflebitisz és diabetikus vaszkulopátia esetén. A találmány vonatkozik továbbá az aktiv adalékanyagból (főleg TPA, pro-TPA vagy ezek keveréke) hatásos mennyiséget tartalmazó gyógyászati készitményekre, melyek olyan szerves vagy szervetlen szilárd vagy folyékony, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat tartalmaznak, melyek alkalmasak 30 parenterális, intramuszkuláris, szubkután vagy intraperitonális adagolásra, és nem okoznak kárt az aktív adalékanyagokban. Vannak megfelelő, főleg infúziós oldatok, előnyösen vizes oldatok vagy szuszpenziók, 35 ezek felhasználás előtt készíthetők el, például az aktiv adalékanyagot egyedül vagy hordozóval, úgymint mannit, laktóz, glükóz, albumin és hasonlók, liofilezett készítményekből. A gyógyászati készítményt sterilezhetjük 40 és szükség esetén segédanyagokkal, például tartósítószerekkel, stabilizálószerekkel emulgeátorokkal, oldódást elösegitó anyagokkal, pufferokkal és/vagy az ozmózis-nyomást szabályozó sókkal keverhetjük össze. A sterile- 45 zést kis pórusméretű (0,45 mikrométer átmérőjű vagy kisebb) szűrön való szűréssel hajtjuk végre, majd szükség esetén a készítményt liofilezzük. Antibiotikumokat is adhatunk hozzá, ez is segít megőrizni a sterili- 50 tást. A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket egységdózisokba osztjuk szét, például dózisonként 1-2 000 mg gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és 55 körülbelül 1-20 mg, előnyösen 3-15 mg aktív adalékanyagot (TPA, pro-TPA vagy ezek keveréke) tartalmazó ampullákba. A betegség fajtájától, valamint a beteg korától és állapotától függően egy körülbelül 60 70 kg súlyú páciensnek kezelés céljából naponta 3-15 mg-os, előnyösen 5-10 mg-os dózist adunk. A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jelle- 65 mezve, hogy a jelen találmány szerinti biológiailag aktív fehérjét gyógyászatilag megfelelő hordozóval keverjük el. Az új fehérjék alkalmazása az emberi test megelőző és terápiás kezelésében is tárgyát képezi a jelen találmánynak. Az ábrák rövid leírása A következő kísérleti részben a jelen találmány különböző részeit közöljük, a függelékben mellékelt rajzokra hivatkozva, melyekben: Az 1. ábra a PH05 gén nukleotid-sorrendjének megállapításában a PH05 gén forrásaként használt pJDB207/P//05, PH03 és pBR322/PH05 Bam-Sal plazmidok részleges restrikciós térképét mutatja. A 2. ábrán a PH05 és PH03 savas foszfatáz gének lokalizációját mutatja az élesztő génbankból izolált 5,1 kb méretű fragmenten. A 3a. és 3b. ábrán a PH05 és PH03 gének promoter-szakaszainak nukleotid-sor- 25 rendjét látjuk. A 4. ábrán a p30 hibrid plazmid készítésének sematikus ábráját látjuk. Az 5. ábra a PH05 terminációs fragmentet tartalmazó p31 plazmid konstruálásának sematikus vázlata. A 6. ábrán a PH05 Sau3A-PstI transzkripciós terminációs fragmentjének nukleotid-sorrendjét látjuk. A 7. ábra a PH05 szignálszakasznak a p31 expressziós plazmidból való kivágását mutatja, pontosabban a p31/R plazmid készítését. A 8. ábrán a 7. ábrán vázolt eljárással kapott kiónokat látjuk. A 9. és 10. ábrán a PH05/R és PH05/Y promoterszakaszokat tartalmazó BamHI-EcoRI restrikciós fragmentek nukleotid-sorrendjét látjuk. A 11. ábrán a Hela sejtekből izolált TPA cDNS klón nukleotid és a megfelelő aminosavsorrendjét látjuk. A 12. ábrán az M13mp9/PH05-TPA klónozó vektor konstruálásának sematikus vázlatát látjuk. A 13. ábrán a PH05 szignálszakaszt tartalmazó pJDB207/PH05-TPA (1A) plazmid konstruálását látjuk. A 14. ábrán a rövidített PH05 transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó pJDB207/P//O5-TPAa plazmid konstruálásét látjuk. A 15. ábrán a rövidített PH05 transzkripciós terminációs fragment nukleotid-sorrendjét látjuk. A 16. ábrán a szignálszakasz nélküli p31RL/TPA (12-2) hibrid-plazmid készítését' latjuk. Az érett TPA-t kódoló szakaszt a PH05 promoterhez kötjük. A 17. ábrán a pJDB307R/PPO5-TPA (12- -2) plazmid készítésének sematikus vázlatát látjuk. 11
