201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
49 HU 201115 B 50 óban 10 mM Tris-HCl (pH8) pufferban oldjuk (p31/P//05-TPAa 2. Xhol). Az Xhol-gyel hasított DNS-ből 5 pg-ot tovább emésztünk Ball-gyel. A teljes megemósztódés utón a DNS-t egyszer extrahóljuk fenol-kloroformmal, 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS-HCl (pH8) pufferban oldjuk. A restrikciós fragmenteket 1,2%-os agaróz gélen Tris-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A nagy 3,9 kb méretű Xhol-Ball fragmentet kis géldarabban kivágjuk a gélből. A DNS fragmentet (A fragment lásd 18. ábra) a géldarabból elektroelúcióval és DE 52 ioncserélő kromatográfiával nyerjük ki a 9Bf példában leírtak alapján. A DNS-L etanolos kicsapással koncentráljuk és 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TR1S-1IC1 (pH8) pufferban oldjuk. 20 Mg p31/P//05-TPAa 2. Xhol DNS-t (lásd fenti) 37 °C-on 45 percig részlegesen emésztünk PstI restrikciós endonukleózzal (0,75 egység/pg DNS) 200 pl 10 mM Tris-HCl (pH7,5) 6 mM magnézium-klorid, 50 mM nátrium-klorid, 6 mM merkapto-entanol és 0,01 mg/ml etidium-bromid összetételű oldatban. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS-HCL (pH8) pufferban oldjuk. A restrikciós fragmenteket 1,2%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. Egy 1,6 kb méretű az érett TPA-t kódoló szakasz legnagyobb részét tartalmazó XhoI-PstI fragmentet (B fragment, lásd 18. ábra) a géldarabból a fentiekben leirt módon elektroelúcióval kinyerjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 40 pg/ml koncentrációban 10 mM TR1S-HC1 (pH8) pufferban oldjuk. A P1105 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz közötti helyes kapcsolódást a (C) 5’-CCAATGCATCTTACCAAGTGATCTGCA-3’ (D) 3’-GGTTACGTAGAATGGTTCACTAG -5’ képletű szintetikus linkerrel hozzuk létre. A linker 5’ végén lévő nyolc nukleotid (5’-CCAATGCA...) a P//05 szignálszakasznak a Ball hasitási helytől a szakasz végéig terjedő darab egy részének felel meg, és 19 nukleotid az érett TPA-t kódoló szakasz 5’ végétől az első PstI helyig terjedő darabnak felel meg (lásd 19. ábra). A C és D oligonukleotidokat a foszfatriészter módszerrel szintetizáljuk. Külön-külön foszforilezzük 5’ végeiken és a 9Ab példában leirt módon egymáshoz illesztjük őket. 60 ng (4 pmól) foszforilezett kétszálú linket- DNS-t 0,4 g pg (0,4 pmól) 1,6 kb méretű XhoI-PstI fragmenthez (B frgament, lásd fent) ligálunk 15 °C-on 16 órán ót 600 egység T4 DNS ligázzal, 15 pl 60 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM ATP, 5 mM DTT összetételű pufferban. Az elegyet 10 percig 85 °C-on tartva inaktivóljuk a ligózt. A liker feleslegét a DNS-nek 10 mM EDTA, 300 mM nátrium-acetát (pH6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropanollal való lecsapásával távolítjuk el. A többszörös linker-DNS-t és a DNS fragmentet Ball és Xhol enzimmel való emésztéssel távolítjuk el. A linker PstI helyen való hozzáadásának következtében az 1,6 kb méretű XhoI-PstI fragmentet Xhol-Ball fragmentté alakítjuk. Ebből az 1,6 kb méretű Xhol-Ball DNS-fragmentből 0,4 pg-ot 1 pg 3,9 kb méretű Xhol-Ball fragmenthez (A fragment lásd fent) ligálunk, 400 egység T4 DNS ligázzal szobahőmérsékleten 16 órán át 10 pl 60 mM TRIS-HC1 (pH 7,5) 10 mM magnézium-klorid, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT összetételű pufferben. A ligáló elegyből 3 és 7 pl-es alikvot adunk 100 pl transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa). 10 transzformált, amp* telepet növesztünk fel külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk elő. A kiónokat a linker-régión átmenő szekvenálással analizáljuk. Egy, a P1105 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz között leolvasási fázisban lévő kapcsolódással rendelkező kiónt (lásd 19. ábra) p31/P//Oő-TPA18 jelöléssel látunk el. A p31/ 17/05-TPAa 2 plazmidot a P 31 / PH 05- T P A a 1, a p31/P//05-TPAa 3 vagy p31/P//05-TPAa 4 plazmiddal helyettesíthetjük. A p31/P//05-TPAa 3 plazmidból származó egyik kiónt például p31/PP05-TPA42 jelöléssel látunk el. 14. Példa Plazmid-kószités a prepro-TPA-t kódoló DNS-sel (20, 21 ábra) A PH05 promotert a prepro-TPA-L kódoló DNS szakaszhoz kötjük. A prepro-régió 35 aminosavát kódoló nukleotid-szakaszt az érett TPA-t kódoló szakasz követi. a) A TPA-t kódoló szakaszt, ideértve, a TPA szignálszakaszt, izolálása (20. ábra) 30 pg pW349E plazmidot BglI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás utána DNS-t tovább emésztjük EcoRI-gyel és BamHI-gyel. A restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz-gélen TRIS-borát EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A 0,9 kb méretű BglI-EcoRI fragmentet lokalizáljuk a gélen és kivágjuk, a gélből. A DNS-t a 9Bf példában leírt módon, elektro-elúcióval nyerjük ki. A 0,9 kb méretű BglI-EcoRI fraginentböl 3,5 pg-ot Hgal restrikciós enzimmel teljesen megemésztve 3 fragmentet kapunk. Az elegyet fenol-kloroformmal exlraháljuk és a DNS-fragmenteket etanollal kicsapjuk. A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 27
