201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
51 HU 201115 B 52 fragmenteken Hgal enzimmel való emésztés sorén keletkező tapadós végeket Klcnow DNS-polimerázzal (1 egység X/pg DNS) feltöltjük, 60 mM TRIS-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid 0,1 mM TTP, 0,1 mM dCTP és 0,1 mM dGTP pufferban. Az elegyet 60 percig 20 °C-on tartjuk, majd a reakciót etunolos kicsapással leállítjuk. A tompa végű DNS-fragmenteket 40-szere feleslegben foszforilezett és párosított EcoRI- linkerrel (Biolabs) keverjük össze. A ligálóst 2000 egység T4 DNS ligázzal végezzük, 16 órán át 15 °C-on, 56 ul 60 mM TRIS-HC1 (pII7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban. A linker-molekulák feleslegét a DNS-nek 10 mM EDTA (p!17,5) és 300 mM nátrium-acetét (pH6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropanolos kicsapásával, távoli tjük el. A DNS-fragmentek keverékét a többszörös linkerek eltávolításéra EcoRI-gyel emésztjük, majd Narl-gyel. A teljes megemésztődés után a restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (p!18,3) pufferban választjuk szét. A 446 bp méretű EcoRI/(llgaI)-NarI fragmentet kivágjuk a gélből és a DNS-t elektroelúcióval izoláljuk (lásd 9Bf példa). b) A TPA-t kódoló szakasz 3' végének egy részét és az élesztő transzkripciós terminéciós jeleket tartalmazó DNS-fragment izolálása (lásd 20. ábra) 10 pg p31/PH05-TPAa 2 plazmidot HindlII enzimmel emésztünk. Fenol-kloroformos extrakciós és etanolos kicsapás után a DNS-t vízben oldjuk, 0,1 mg/ml koncentrációban és NarI enzimmel emésztjük. A restrikciós fragmenteket 1% agaróz-gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. Az 1,4 kb Narl-HindllI fragmentet izoláljuk és elektroelúcióval kinyerjük az agaróz géldarabból (lásd 9Bf példa). c) A vektorszakaszokat és a PH05 promote rt tartalmazó UNS-fragment izolálása (lásd 21. ábra) 5 * * * * * * 12 5 pg p31R plazmidot HindlII és EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztünk. A restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A 3,9 kb méretű Hindiit-EcoRI DNS-t tartalmazó géldarabot kivágjuk és a DNS-t elektroelúcióval izoláljuk. dl A fragmentek ligálása (lásd 21. ábra) 0,3épmól 3,9 kb méretű IlindlII-EcolU fragmentet 0,3 pmól 1,4 kb méretű Narl-HindlII fragmentet és 0,6 pmól 446 bp méretű EcoRI-NarI fragmentet ligálunk 480 egység T4 DNS-ligázzal 15 °C-on 6,5 órán át 12 pl 60 mM Tris-HCl (pI17,5) 10 mM magnézi-um-klorid, l mM ATP és 5 mM DTT összetételű pufferban. A ligáló elegyből 5 és 7 pl-es alkivot részeket adunk 100 pl, kalciummal kezelt transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa). 23 traszformált, ampR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon. A különböző kiónokból származó plazmid DNS-eket PstI enzimmel emésztve analizáljuk. Az egyik, várt restrikciós mintázattal rendelkező kiónt p31R/SS-TPAa 2 jelzéssel látjuk el. A p31/PH05-TPAa 2 plazmidot helyettesíthejük a p31/PH05- -TPAa 3 plazmiddal, vagy a 13a. példában szereplő egyik klónnal. A plazmidok készítését a feniek szerint végezzük. A p31/PH05- -TPAa 3 plazmidból származó egyik kiónt p31R/SS-TPAa 3 jelzéssel látjuk el. 15. Példa A PH05 kódoló szakaszba benyúló P1105 szignálszakasszal rendelkező plazmid készítése (lásd 22-24. á) Ha idegen DNS-t kapcsolunk a P1105 szignálszakaszhoz, akkor a szignálpeptid hasítási helye melletti aminosavak különböznek az eredeti P1IQ5 fehérje aminosavaitól. Az aminosav-sorrend változása befolyásolhatja a fehérje szignálpeptidázzal való hasításának hatásfokát. Ezért a következő DNS-konstrukciókban olyan PII05 szignálszakaszt használunk, mely az éreLL savas foszfatázt kódoló szakasz egy részét is tartalmazza. Csak a szignálszakasz után különböző távolságban kapcsoljuk az élesztő endopeptidáz hasítási helyét tartalmazó oligodezoxinukleotidon keresztül leolvasási fázisban, az érett TPA-t kódoló szakaszt. Az endopeptidáz hasítási hely jelenléte megakadályozza fúziós fehérjék létrejöttét. a) Az érett savas-foszfatázt kódoló szakasz egy részét tartalmazó P1105 szakasz szuhklónozása Olyan DNS fragmenteket izolálunk, melyek a PII05 promotert, P1105 szignálszakaszt és az érett savas-fosztatázt kódoló szakasz különböző hosszúságú részeit tartalmazzák. A BamlII hasítási helytől 5’ irányban 595, 637, 811 és 1312 nukleotid távolságra Hsai restrikciós helyek találhatók. (48). Mivel a P1105 szignálszakasz a 592. sorszámú nukleotidig terjed, a különböző Rsal hasítási helyek az érett savas foszfatázt kódoló szakaszban a 3, 45, 219 és 720 sorszámú bázisoknál találhatók. A BamlII-Rsal fragmenteket az Rsal hasítási helyet Xbal hasítási hellyé átalakító szintetikus oligonukleotidon keresztül szubklónozzuk. A P.IDB207/PII05, pI103 plazmid-DNS-t (lásd 2. példa) BamlII és Hpal restrikciós en-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 28
