201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
47 HU 201115 13 48 Élesztő sejtkivonatok készítése és a TPA aktivitás meghatározása 5 Alacsony foszfáttartalmú tenyészlében (48) l-2xl07/ml sűrűségre növő sejteket centrifugálunk Sorvall SS34 rotorban 10 percig 3000/perc fordulatszámmal. A kiülepített sejteket a tenyészlé sókomponenseit tártál- 10 mazó pufferral (azaz aminosavak vitaminok, nyomelemek nélkül) mossuk. A sejteket szobahőmérsékleten 5 percig 3000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A kiülepitett sejteket 4 ml össztérfogatban szuszpendáljuk hideg, 15 66 mM nátrium-foszfát puffer (pH7,4) és 0,1% (v/v) Triton X-100 összetételű oldatban. A sejt8zuszpenziót átvisszük egy 30 ml-es Co-12. Példa rex-csőbe, 8 g 0,5 mm átmérőjű üveggyöngyöt adunk hozzá és a szuszpenziót 4 percig teljes sebességgel rázatjuk egy Vortex Mixeren (Scientific Instruments Inc., USA), majd jégfürdőben lehűtjük, tízzel az eljárással a sejteknek több mint 90%-a felrázódik. A sejttörmeléket és az üveggyöngyöket Sorvall HB-4-es rotorban 10 percig 4 °C-on 8000/perc fordulatszómmal centrifugálva ülepítjük. A felülúszót Eppendorf csövekbe tesszük, cseppfolyós nitogénben lefagyasztjuk és -60 °C-on tároljuk. A TPA-aktivitást Flanby (49) módszerének csekély módosításával határozzuk meg. D-Val-Leu-Lys, pNA-t (Kábái S-2251) használunk szubsztrátként. A 405 nm-es abszorpciót nem-specifikus hasításra korrigáljuk és urokináz standardhoz viszonyítjuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók. 2. Táblázat TPA aktivitás különböző rekoinbináns plazmidokkal transzformált S. cerevisiae GRF18 törzsben Plazmid TPA aktivitás (egység/1 -sejttenyészet ODAoo) Represszált (magas Pl) élesztöderepresszált (alcsony Pi) pJDB207/P//O5-TPA( 12-2)-60 pJDB207/P//O5-TPA(lA) 20 625 PJDB207/P//O5-TPAa 1-600 pJDB207/P//O5-TPAa 2-700 PJDB207/P//O5-TPAa 3-650 pJDB207/PH05-TPAA 4 625 13, Példa A P1I05 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz közötti pontos összekapcsolódást tartalmazó plazmid konstrukciója (18. ábra) Ez a konstrukció egy szintetikus oligodezoxinukleotid felhasználósával korrekt kapcsolódóst hoz létre a PH05 szignólszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz között. Az egyszerűség kedvéért a pJDB207/P//O5-TPAa 2 plazmid (lásd 8e. példa) megfelelő szakaszát a p31 plazmid ban (lásd 5. példa) szubklónozzuk. a) A p31 /Pl 105- TPA a 2 plazmid izolálása Mind a pJDB207/P//O5-TPAa 2 (lásd 8e. példa) mind a p31 plazmidból 2 /ug-ot Hindii! és Sáli restrikciós endonukleázzal emésztünk. A teljes megemésztődés után DNS-fragmenteket, 0,6%-os alacsony olvadáspontú ngaróz-gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A pJDB207/P//05-TPAa 2 plazmid 2,6 kb méretű HindlII-Sall fragment-40 jét, valamint a p31 plazmid 3,1 kb méretű HindlII-Sall fragmeritjét kivágjuk a gélből. A góldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk és az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkentése céljából vízzel hígítjuk. Mindkét fragmentböl 45 ekvimorólis mennyiséget keverünk össze és 100 pl térfogatban 4 órán ót 15 °C-on Egáljuk. A ligáló elegyből 10 pl-t használunk kompetens é. coli HB101 sejtek transzformálására. Néhány ampH telepet analizálunk. A 50 korrekt DNS-darabot tartalmazó kiónt p31/P//ü5-TPAA 2 jelöléssel látjuk el. Ugyanezt a konstrukciót állítjuk elő a pJDB207/PHU5-TPA& 1, pJDB207-TPA A 3 és pJDB207/PH05-TPAA 4 plazmidokkal is (lásd 55 öe. példa). A kapott plazmidok jelölése p31/PH05-TPAa 1, p31/PH05-T PAa3 és p31/PI/05-TPAa 4. b) A p.l 1/PHÜ5-TPA18 plazmid ké- 60 szitése (18. ábra) 30 pg p31/ P//05-TPAa 2 DNS-t Xhol restrikciós endonukleázzal emésztünk. A linearizált DNS—t fenol-kloroformmal extraháljuk, 65 etanollal kicsapjuk és 0,5 mg/ml koncentráci-26
